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生物标志物对于早期诊断疾病、监测疾病进展和评估治疗反应至关重要。质谱平台已成为该领域的强大工具，被广泛应用于发现和定量样本中的分析物。然而，将高分辨质谱平台上的非靶向发现研究转化为特定生物标志物组合的临床检测应用是一个富有挑战且耗时的过程。赛默飞新型Stellar质谱仪，凭借其卓越的定性、定量分析和高通量检测性能，全面加速生物标志物的规模转化验证工作流程。
研究目的
本研究案例旨在评估新型Thermo Scientific™ Stellar™ 四极杆超高速双压线性离子阱质谱仪PRM定量分析性能。加速将血浆蛋白质组大规模生物标志物的发现结果快速转化为精确、可靠的临床靶向定量检测应用。
研究背景
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在血浆中定量检测生物标志物提供了一种高度可及且最小侵入性的疾病诊断方法，已被广泛应用于各种疾病的诊治过程，如早期癌症检测等。
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非靶蛋白质组质谱在血浆生物标志物发现中具有巨大潜力；然而，将其转化为针对下游验证的靶向定量检测可能耗时且繁琐。
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采用Stellar新型质谱系统使得非靶生物标志物的发现结果可以快速转化为针对下游验证的靶向定量检测方法。
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本研究开发了具有不同的通量和肽段的多种检测方法，以评估Stellar质谱仪在验证来自两个大队列生物标志物的能力（每个研究分别包含2,513名和3,000名受试者）。
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采用Stellar 质谱仪仅在3天内完成定量检测方法开发，60分钟检测约1,960个标志物（约3,920个肽）。并通过此靶向检测方法对生物样本队列生物标志物的进行确证。
实验方法
样品制备和数据采集（图1）
1)
通过Proteograph™ Product Suite XT (Seer Inc.) 处理40份混合男性和女性血浆，以制得Proteograph血浆样本。
2)
通过对几份混合血浆标准样本进行S-trap消化，制得纯血浆消化样本。
3)
制备了2,163个稳定同位素标签（SIL）肽用于靶向定量检测分析。这些检测分析依据不同检测通量和分析物数量分为三类：P100（高通量，数十个分析物），P800（中通量，数百分析物）和P2000（低通量，数千分析物）。
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对于P100测定使用纯血浆消化样本作为背景基质，对于 P800 和 P2000 测定则使用Proteograph处理血浆样本作为背景基质；
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2,163个SIL肽用于P2000测定方法的开发，该检测方法最终包含1,960个靶标；
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所有混合物都用0.1%的甲酸和95%水/5%乙腈的缓冲液稀释。
4)
所有准备好的样本都在Vanquish NEO液相色谱串联Stellar质谱仪上进行数据独立采集（DIA）或并行反应监测（PRM）采集建立靶向分析方法。
5)
使用Skyline（v23.1）和PRM conductor（Skyline插件）来加速PRM检测方法构建及数据质量评估。
（点击查看大图）
研究数据验证
作为验证研究的一部分，所收集的44例（23名癌症患者和21名非癌症对照）血浆样本同样通过上述方式处理，并在NEO-Stellar MS系统上使用P2000分析。
实验结果
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在3天内完成了所有检测方法的开发，定量分析性能和检测特异性满足要求（图2）。
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在3个不同的检测通量条件下评估了P100检测：100 SPD，144 SPD 和180 SPD（图3）。虽然在所有3个检测通量条件下都保持了定量性能，但是随着检测通量的增加，所测得的蛋白数量减少。
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该研究还调查了蛋白质组生物标志物验证的最佳上样量。由于其高定量重现性和灵敏度，600 ng 被确定为最佳上样量（图4）。
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随着基质质量的增加，所鉴定出的内源肽数量增加（图4A）；
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在宽的上样量范围中，Stellar 质谱仪显示出了高定量重复性（变异系数<10%）（四次注射）（图4B）。
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在完整血浆消化物中添加98个SIL肽的100 fmol数据，突显了Stellar MS在数日血浆蛋白质组生物标志物验证中的稳健性和可重复性（图5）。
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靶向检测方法被应用于由 23 名癌症患者和 21 名非癌症对照组成的生物队列。Stellar 质谱仪成功检测出 1,960 种 SIL 肽中的 1,913 种，证明了其能够全面覆盖目标肽段及临床应用潜力。Stellar质谱平台在几天内表现出高度的重现性和稳定性，CV 小于 12%（图6）。
结 论
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使用NEO-Stellar 液相色谱串联质谱系统开发的P100、P800和P2000检测，显示出了系统出色的定量性能和检测特异性，并且整个过程仅需1 - 3天的工作量。而相比之下，使用传统方法和三重四极杆平台则需要数周甚至数月的时间。
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将P100检测的通量提高到100 SPD、144 SPD和180 SPD，证明了Stellar 质谱仪在高检测通量下仍保持一致的定量性能。
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测试了一系列Proteograph血浆上样量，并最终选择了600 ng的最佳基质上样量用于蛋白质生物标志物的验证。
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NEO-Stellar系统在靶向蛋白质组学检测中的稳健性、可重复性（< 12%的日间CV）和灵敏度表现，可应用于比以往技术更大规模的潜在生物标志物的高效验证转化。
赛默飞一直致力于更好地服务开创人类健康未来的科学家，包括全新一代Thermo Scientific™ Stellar™质谱仪在内的新一代蛋白质组学工作流程，为广大科学家们量身定制了从样品自动制备、纳流液相色谱、离子淌度到人工智能增强型数据处理软件的无所不包的一流实验室配置。这意味着广大用户在在实验过程中，从硬件到软件的无缝衔接，也意味着蛋白质组学从发现组学到临床发现验证的无缝衔接。
参考资料：
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