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崔宇 冉良骥
母乳被公认为是婴儿最理想的食物，最佳的营养来源，母乳已经检测出至少含有400多种营养物质，其中的母乳低聚糖（HMOs）是人类母乳中的第三大固体组分，仅次于乳糖（55-70g/L）和脂肪（15-40g/L）， HMOs 是一类包含 200 多种不易消化且非营养性的低聚糖混合物，其具有重要的生物学功能，不仅对肠道病原微生物起到抗感染的作用，还能维持肠道微生态的平衡，更有利于婴儿神经系统发育，并可降低免疫相关的非传染性疾病的发生。目前婴幼儿配方奶粉主要是用动物的乳为原料，特别是牛乳，而牛乳中HMOs的含量非常少，所以在配方奶粉中添加HMOs就非常有必要，这样可以最大限度地减少配方奶粉喂养和母乳喂养婴儿之间的发育差异，从而可能改善配方奶粉喂养婴儿的整体健康状况。而随着国内监管机构的公示和批准， HMOs现已被正式允许用于国内婴幼儿配方奶粉，含有HMOs的婴幼儿配方奶粉也陆续开始上市销售。
国家卫健委于2023年10月7日发布公告，正式批准母乳低聚糖（HMOs）中的2´-FL（2´-岩藻糖基乳糖）和LNnT（乳糖-N-新四糖）可作为食品营养强化剂应用于婴幼儿配方奶粉、调制乳粉（儿童用)，以及特殊医学婴儿食品[1]。国家食品安全风险评估中心于2024年3月13日发布，拟征求意见的食品营养强化剂新品种中，涉及3´-SL（3´-唾液酸乳糖钠盐）和6´-SL（6´-唾液酸乳糖钠盐）均属于HMOs[2]。这些品种原料的检测方法均涉及电雾式检测器（CAD）。
图：CAD检测器（左：Corona Veo 系列，右：Vanquish CAD系列）
乳糖-N-新四糖CAD测定结果
1.1 依据公告文件方法，完成系统适应性测试，溶剂连续进样至少五次，待液相色谱响应稳定后在电雾式检测器条件下进行系统适用性测试。满足下表条件后可进行乳糖-N-新四糖及乳糖-N-新四糖果糖异构体含量测试，测定结果均可满足系统适应性要求，结果见下表所示。
表1. 系统适用性要求及测试结果
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1.2校正曲线测定结果
乳糖-N-新四糖通过紫外检测器测定，其线性校正曲线结果如下图所示，从结果可知，乳糖-N-新四糖在160-240µg/mL浓度范围内，强制过零点，通过一次线性拟合，结果良好，相关系数R2为0.99941，满足＞0.995要求。
乳糖-N-新四糖果糖异构体通过CAD检测器测定，其线性校正曲线结果如下图所示，从结果可知，乳糖-N-新四糖果糖异构体在6-100µg/mL浓度范围内，通过二次线性拟合，结果良好，相关系数R2为0.99996。
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1.3定量限测定结果
对乳糖-N-新四糖果糖异构体的定量限进行考察，结果为6.0µg/mL。按标准中样品浓度0.2 mg/mL计算，乳糖-N-新四糖果糖异构体的检出浓度可达0.3%，高于当前标准公示1.0%限度要求，完全满足原料质控的需求。
1.4实际样品分析测定结果
运用本文方法，串联紫外检测器和CAD检测器，完全可以满足对不同批次营养强化剂乳糖-N-新四糖原料中乳糖-N-新四糖（紫外测定）和乳糖-N-新四糖果糖异构体（CAD测定）的含量同时测定的需求，乳糖-N-新四糖果糖异构体CAD结果和乳糖-N-新四糖紫外结果如下图所示。
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2´-岩藻糖基乳糖原料CAD测定结果
依据公示方法，通过CAD检测器及对应色谱方法，测定结果下图所示，可满足原料中2´-岩藻糖基乳糖原料中的D-乳糖和二岩藻糖基乳糖含量测定质控的需求。
图 2’岩藻糖基乳糖样品色谱图
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3´-唾液酸乳糖钠盐&6´-唾液酸乳糖钠盐CAD测定结果
依据公示方法，通过CAD检测器及对应色谱方法，结果如下图所示，本方法适用于原料中3´-唾液酸乳糖钠盐及异构体3´-唾液酸乳果糖，6´-唾液酸乳糖钠盐和乳糖含量同时测定质控的需求。
图 乳糖、3´-唾液酸乳糖钠盐&6´-唾液酸乳糖钠盐标品色谱图（点击查看大图）
小结
通过紫外检测器串联电雾式检测器（CAD）成功复现了母乳低聚糖中LNnT(乳糖-N-新四糖)当前公示的国家标准方法。虽然待测物没有明显的紫外吸收，但对于原料中含量较高的主成分，公示方法采用紫外检测器末端吸收205nm进行测定，效果较为理想；而对于需要重点控制的主要杂质乳糖-N-新四糖果糖异构体，由于限度较低，公示标准采用了更加灵敏的CAD检测器进行分析，方法学考察结果显示，灵敏度和重现性均符合标准要求。
基于CAD检测器对无/弱紫外吸收物质检测的优势，其他类型的母乳低聚糖，如2´-FL（2´-岩藻糖基乳糖）、3´-SL（3´-唾液酸乳糖钠盐）及6´-SL（6´-唾液酸乳糖钠盐），也同样适用。同时，本方法也可用于婴幼儿配方奶粉、调制乳粉(儿童用)以及特殊医学婴儿食品中LNnT含量的测试，可作为相关行业分析人员进行该领域分析的重要参考。
参考文献：
[1] 《关于桃胶等15种“三新食品”的公告》（2023年第8号），国家卫生健康委，2023年9月22日.
[2] 关于公开征求羟基酪醇等7种食品添加剂新品种意见，国家食品安全风险评估中心，2024年3月13日.
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