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序列特异性识别的双链核酸是必不可少的分子诊断和原位成像。聚类规则间隔的短回文重复序列和Cas系统依赖于原间隔邻近基序(PAM)依赖的双链DNA (dsDNA)识别，限制了可靶向序列的范围并导致不希望的脱靶效应。
2024年9月18日，北京化工大学苏昕团队在Nature Biotechnology（IF=33）在线发表题为“Bacteriophage λ exonuclease and a 5′-phosphorylated DNA guide allow PAM-independent targeting of double-stranded nucleic acids”的研究论文，该研究发现噬菌体λ外切酶和5'-磷酸化的DNA引导允许PAM独立的双链核酸靶向。
利用单分子荧光共振能量转移分析，研究人员发现了噬菌体λ外切酶(λExo)的酶活性。研究发现5'-磷酸化单链DNA (pDNA)与dsDNA和DNA-RNA双链上的互补区域结合，而不需要PAM样基序。结合后，λExo-pDNA系统在Mg2+存在下催化将pDNA消化成核苷酸。该过程对大范围的pDNA结合区域内的错配非常敏感，从而在各种应用中具有特殊的序列特异性和减少脱靶效应。不需要特定的基序，如PAM序列，极大地拓宽了靶标的范围。该研究证明了λExo-pDNA系统是分子诊断，DNA计算和基因成像应用的多功能工具。序列特异性识别双链核酸对分子诊断和原位位点成像至关重要。聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统已经彻底改变了基因组编辑、表达干扰和分子诊断领域。Cas蛋白介导引导RNA (gRNA)，通过识别原间隔器邻近基序(PAM)来询问和切割靶核酸。此外，在目标识别后，一些Cas蛋白对单链报告核酸表现出不加区分的切割活性。这一特性使得设计各种先进的分子诊断方法成为可能。催化抑制的Cas蛋白(dead Cas, dCas)已被证明是一种无需切割即可识别基因的强大工具。当dCas靶向dsDNA时，不会诱导双链断裂，而是维持与目标DNA的结合。因此，CRISPR-dCas可以访问高度定位的基因组DNA，而无需进行全局变性。研究人员利用细胞系中的CRISPR-dCas9复合物实现了基因组位点成像。然而，CRISPR-Cas 系统的PAM依赖性和脱靶效应不仅限制了其靶标谱，而且对识别特异性也提出了挑战。噬菌体λ外切酶(λExo)识别5'-磷酸化的dsDNA，并以过程方式消化5'-磷酸化链，释放5'单核苷酸并留下长长的3'overhang。λExo对非磷酸化DNA 和单链DNA（ssDNA）具有低催化活性。晶体结构表明，它形成一个环形的同型三聚体，中心有一个漏斗状的通道，用于沿DNA移动。dsDNA进入通道的宽端。5 '链在三个活性位点之一被消化，而3 '链则通过通道的窄端并从后部退出。其底物结合和催化活性在很大程度上受其带正电的底物口袋中的关键氨基酸残基的影响。λExo消化dsDNA 5'-磷酸化链的典型特性已被用于处理磷酸化扩增产物、放大信号和检测ssDNA的突变。然而，目前的研究并没有表明λExo可以侵入非磷酸化的dsDNA或带有引导DNA链的DNA-RNA双链。λExo介导的以smFRET表征的ds-酸的pDNA询问（图源自Nature Biotechnology）在这里，作者使用单分子荧光共振能量转移(smFRET)分析发现了λExo的一个非平凡性质。这一特性有助于5'-磷酸化的ssDNA (pDNA)结合并解除与pDNA具有互补序列的dsDNA靶标。在Ca2+存在的情况下，pDNA和λExo能够与靶标保持结合，而在Mg2+存在的情况下，pDNA被λExo快速消化。缺少靶标可以完全阻止pDNA的消化。在pDNA与靶标互补区域的5 '端或靠近中间的单个错配阻止了pDNA的结合和酶切，这证实了λExo激活是可控的。这种非平凡性质的优势导致了在生理或室温下使用简单的荧光猝灭试验直接检测合成dsDNA, DNA-RNA双链和扩增产物的潜力。利用λExo-pDNA系统建立核酸检测，可快速等温检测病原菌基因和相关单核苷酸突变。可以执行逻辑和扩增操作的DNA响应回路被开发出来。此外，利用λExo-pDNA系统实现了人端粒基因组位点和人黏液蛋白4基因(MUC4)的原位荧光成像。这种成像方法很容易采用无酶扩增允许信号增强。此外，在基因座成像应用中可以检测到单个不匹配。在上述所有应用中，λExo-pDNA复合物不需要特定的基序，如Cas蛋白的PAM，从而大大扩展了目标谱。此外，λExo-pDNA表现出优异的单错配敏感性，允许识别广泛的突变。总的来说，该研究揭示了λExo作为dsDNA识别工具的一个重要特征，并揭示了λExo的酶学特性，使ds-核酸在环境温度下的序列特异性鉴定成为可能。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02388-9
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