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碱基编辑器(BEs)的连续定向进化在细菌细胞中已经成功，但在哺乳动物细胞中尚未成功。
2024年9月17日，广州大学王刚，广州医科大学高宗良，西安医科大学周建共同通讯在Nature Communications 在线发表题为“Evolved cytidine and adenine base editors with high precision and minimized off-target activity by a continuous directed evolution system in mammalian cells”的研究论文，该研究结果表明，CDEM是一种简单而有效的方法，可以在哺乳动物环境中不受大小限制地连续进化生物，这比细菌细胞中的连续定向进化系统更有优势。
研究阐述了哺乳动物细胞连续定向进化系统(CDEM)的发展。CDEM使BE与Cas9缺口酶全长进化。利用CDEM进化胞嘧啶碱基编辑器BE3和腺嘌呤碱基编辑器ABEmax和ABE8e的脱氨酶。BE4结构上进化的胞苷脱氨酶变体不仅显示出更窄的编辑窗口，而且具有更高的编辑纯度和更低的脱靶活性，而不牺牲靶向活性。进化的ABEmax和ABE8e变体在不同程度上显示出缩小或移动的编辑窗口，并且降低了脱靶效果。
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CRISPR-Cas系统或碱基编辑器(BEs)已被广泛研究以提高其性能，包括编辑效率、特异性或精度。定向进化已成为实现这一目标的一种关键方法。单细胞环境下的定向进化已经成功地提高了Cas蛋白的特异性或拓宽了原间隔器邻近基序(PAM)的兼容性，并提高了包括腺嘌呤碱基编辑器(ABE)、胞苷碱基编辑器(CBE)和C-to-U RNA碱基编辑器在内的生物的编辑活性或修改了编辑窗口。尽管取得了巨大的成功，但目前基于单细胞的进化系统仍然面临着一些挑战。定向进化的蛋白质在单细胞环境下的表现在转移到哺乳动物环境时可能会动摇甚至失效。其原因可能是由于真核生物和原核生物中不同的运输、区隔化、蛋白质成熟和非天然辅助因子的机制。此外，基于原核生物的进化系统，包括噬菌体辅助连续和非连续进化(PACE和PANCE)，在进化过程中利用死亡的Cas9 (dCas9)而不是Cas9缺口酶(Cas9n)。然而，与dCas9相比，Cas9n通常用于BE，以提高哺乳动物细胞的编辑效率。此外，受噬菌体有效载荷大小(~4.4 kb)的限制，PACE采用了拆分格式的BE。这些差异可能会破坏细菌进化的有效性，以及进化产物在转移到哺乳动物细胞时的功能。哺乳动物细胞中CRISPR-Cas系统或BEs的定向进化落后于单细胞进化系统。迄今为止，仅有少数基于哺乳动物细胞的连续定向进化系统被报道，它们都是基于病毒的进化系统，将病毒的传播与进化目标的功能结合起来。然而，没有报道这些系统进化出BEs或CRISPR/Cas蛋白。其中一个原因可能是设计一个将病毒传播与基因编辑结合起来的功能进化回路所面临的挑战。此外，病毒系统的有效载荷大小是一个限制因素，特别是对于需要导入病毒基因组的大尺寸进化靶标，而编码Cas蛋白或BE的基因通常很大(例如BE通常大于5kb)。与连续定向进化相比，非连续定向进化或筛选有一些缺点。首先，体外诱变产生的突变变体有限，限制了其效率和广泛应用。其次，进化的成功取决于进化的总整数，因此，通过不断的进化，效率可以显著提高。目前，关于哺乳动物细胞中Cas蛋白或BE的非连续定向进化的报道很少。综上所述，为了进一步改进CRISPR系统或BEs，需要在哺乳动物细胞中建立一个连续的定向进化系统。CDEM的总体示意图（图源自Nature Communications ）CBE和ABE能够在不依赖于双链断裂(DSBs)的情况下在靶DNA中实现可编程的单碱基转换，并且在需要精确编辑和低脱靶活性的情况下显示出巨大的治疗潜力。然而，一些挑战阻碍了它们的治疗应用，其中之一是CBE和ABE可以在其编辑窗口内编辑所有靶标，从而产生不希望的旁观者碱基编辑。例如，最先进的ABE8e在DNA和RNA水平上具有非常宽的编辑窗口和高脱靶活性。尽管有几项研究报道通过结构引导的蛋白质工程缩小了CBE和ABE的编辑窗口，但这些窗口优化的变体在DNA和RNA水平上仍然存在产品纯度和脱靶效应。据所知，到目前为止，通过定向进化缩小或改变编辑窗口还没有报道。研究通过结合CRISPR-X30进行体内诱变和抗生素抗性进行正选择，在哺乳动物细胞中开发了一个连续定向进化系统(CDEM)。利用CDEM分别进化了BE3的胞苷脱氨酶组分和ABEmax和ABE8e的腺苷脱氨酶组分，生成了编辑窗口缩小或移动、产品纯度更高、脱靶效应更低的CBE和ABE变体。
https://www.nature.com/articles/s41467-024-52483-3![]()
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