Immunity（IF=25.5）：四川大学等团队解析HIF2α在哮喘中的作用

缺氧是哮喘患者气道中的一个明显特征，而细胞对缺氧的反应往往涉及到缺氧诱导因子的激活。于是，研究人员探究了HIF2α在Th细胞分化中的功能。在分析哮喘和慢性鼻炎患者的CD4+ T细胞的单细胞转录组数据后，他们发现EPAS1（HIF2α编码基因）在Th2细胞中高表达。同样，在哮喘小鼠中，Epas1也在Th2细胞中高表达。在整合人类和小鼠Th2细胞的scRNA-seq数据后，他们发现Th2细胞可分为6个亚簇。其中，EPAS1/Epas1在C1亚簇中高表达，并与这两个物种的致病性Th2特征基因呈正相关，这表明EPAS1/Epas1在致病性Th2细胞中发挥潜在功能。

为了研究HIF2α在Th细胞分化中的功能，研究人员构建出T细胞条件性缺失HIF2α小鼠（CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠）。他们发现，HIF2α缺失会显著影响Th2细胞的体外分化，并减轻小鼠哮喘模型的气道炎症。重要的是，在CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠的支气管肺泡灌洗液和肺部，Th2细胞的比例和数量显著减少，IL-4、IL-5、IL-13以及IgE的水平也下降。他们还将WT小鼠和CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠的骨髓细胞等量混合后移植到小鼠体内，再次建立哮喘模型。他们同样观察到Th2细胞分化受损，表明HIF2α缺失以T细胞内在方式影响Th2细胞分化，而不是受到不同遗传背景下的炎症状态差异影响。

为了在单细胞水平上全面表征受HIF2α调控的Th2细胞的特性，研究人员从WT和CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠哮喘模型中分离出肺泡灌洗液细胞，并开展了scRNA-seq和scTCR-seq分析。他们发现，在CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠中，Th2细胞比例下降2倍，且HIF2α缺陷型Th2细胞功能受损。此外，Th2细胞可被进一步细分为6个亚群（图1）。与WT对照组相比，CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠的C1亚群比例显著下降，而C2亚群则几乎增加一倍。

转录组分析表明，C1细胞高水平表达Gata3、Epas1、Il1rl1、Il2ra和Pparg，与致病性Th2细胞非常相似；C2细胞则高水平表达Ikzf2、Foxp3和Ccr5。同时，C0细胞表现出干细胞样表型，其特征是Slamf6、Tcf7和Cd200等基因的表达（图1）。因此，研究人员将C0称为干细胞样Th2，将C1称为致病性Th2。此外，他们在哮喘小鼠的颈部浅表淋巴结和脾脏中也发现了干细胞样、致病性和Ikzf2+ Th2亚群。这些结果表明，Th2细胞的异质性是致病性2型免疫反应的共同特征。

克隆多样性分析表明，C0 Th2中的TCR多样性较高，与其干细胞样特征一致。于是，研究人员以初始CD4+ T细胞作为起点，利用Monocle3进行拟时间排序，重建了从C0到C4的发育轨迹。如预期一致，干细胞样细胞（C0）位于初始T细胞之后，在C3和C4之间形成分支，最终形成致病性Th2（C1）和Ikzf2+ Th2（C2）细胞（图1）。根据WT细胞和HIF2α缺失细胞沿轨迹的分布，他们观察到WT细胞倾向于向C1分化，而HIF2α缺失细胞则更多分化为C2细胞。这些结果显示HIF2α在干细胞样Th2细胞极化为致病性Th2细胞的过程中发挥重要作用。

图1 单细胞RNA测序鉴定出异质性的Th2细胞亚群[1]

研究人员观察到，在哮喘诱导过程中，CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠肺部和肺泡灌洗液中的致病性Th2细胞显著减少，但干细胞样Th2细胞比例增加，表明在缺乏HIF2α的情况下，干细胞样Th2向致病性Th2的分化可能受损。接下来，通过体外分化和体内移植实验，他们观察到HIF2α缺失会显著影响干细胞样Th2细胞向致病性Th2细胞的分化，还会导致干细胞样Th2细胞的增殖能力下降，表明HIF2α调控了干细胞样Th2细胞的分化和功能。值得注意的是，将HIF2α缺失的致病性Th2细胞过继转移至Rag1^-/-小鼠（由赛业生物提供）时，小鼠肺部未观察到免疫细胞浸润，IL-4、IL-5和IL-13的表达也显著降低，表明HIF2α在促进致病性Th2细胞功能方面也起着至关重要的作用。

在干细胞样Th2细胞向致病性Th2细胞分化的过程中，Epas1的表达与Gata3的诱导同步，因此研究人员假设这些转录因子在分化过程中起着功能协调作用。他们发现，HIF2α促进了Gata3的转录活性，而GATA3在调控Epas1表达中也发挥了重要作用（图2）。后续CUT&Tag分析证实了Epas1和GATA3之间的转录调控。在HIF2α缺失的干细胞样和致病性Th2细胞中，磷脂酰肌醇代谢物显著减少，表明HIF2α-GATA3转录回路可能参与调节磷脂代谢，而单独受GATA3调控的基因则参与了趋化因子产生、维生素代谢以及PI3K-AKT通路的负调控。这些结果表明，HIF2α通过与GATA3协调在干细胞样Th2向致病性Th2的分化过程中发挥独特作用。

那么，HIF2α缺失是否影响PI3K-AKT通路的激活？他们发现，在缺乏HIF2α的情况下，TCR诱导的AKT、S6K和FOXO1磷酸化减少，表明IL4-HIF2α级联参与了Th2分化过程中PI3K-AKT的激活。在应对TCR或细胞因子刺激时，脂质激酶产生的磷脂酰肌醇对激活PI3K-AKT通路至关重要。他们发现编码肌醇多磷酸激酶（IPMK）的Ipmk基因是受到HIF2α和GATA3共同调控的潜在基因。在CD4Cre⁺ Epas1^f/f小鼠的干细胞样和致病性Th2细胞中，Ipmk表达都显著减少，暗示了PI3K-AKT激活缺陷的机制。在HIF2α缺失的T细胞中过表达IPMK可以挽救Th2分化并促进致病性Th2细胞分化，还可以恢复PIP3的合成并促进AKT及其下游信号级联的激活。相反，IPMK抑制剂限制了AKT-FOXO1激活，因此严重损害了Th2分化。这些结果表明，在致病性Th2分化过程中，HIF2α-GATA3回路主要通过调节IPMK的表达来维持TCR-PI3K-AKT的激活。

图2 HIF2α和GATA3合作促进致病性Th2分化^[1]

最后，研究人员评估了HIF2α抑制剂PT-2385在治疗哮喘相关气道炎症上的潜力。他们发现PT-2385能显著抑制Th2的体外分化。哮喘小鼠经过PT-2385治疗后，炎症细胞浸润显著下降，Th2细胞频率和数量显著减少，肺泡灌洗液中的L-4、IL-13和IL-5水平降低。scRNA-seq分析表明，PT-2385治疗降低了致病性Th2细胞的频率，并降低了多个Th2亚群中2型免疫反应、细胞因子产生以及PI3K激活相关通路的富集得分。这些数据凸显了PT-2385在治疗哮喘上的潜力。

图3 HIF2α通过调节IPMK表达和磷脂酰肌醇代谢^[1]

这些研究证实HIF2α通过调节IPMK表达和磷脂酰肌醇代谢，在干细胞样Th2细胞向致病性Th2细胞的分化中发挥关键作用（图3）。因此，HIF2α促进了致病性Th2细胞反应，加剧了Th2介导的哮喘炎症。抑制HIF2α可减轻这一过程并缓解气道炎症，为治疗Th2介导的哮喘提供一种潜在策略。

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