干细胞上清液、裂解液、外泌体都是干细胞？

撰文：想要两颗西柚

修订：南山小仙

来源：新干细胞者说

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干细胞上清液

干细胞上清液是从干细胞培养液中去除干细胞以及其他所有细胞成分后余留的液体，由培养基、细胞因子以及外泌体三部分组成。干细胞培养基要维持干细胞的“干”性本身就富含营养成分，而干细胞上清液是在培养基原有的基础上叠加了干细胞分泌大量细胞活性因子，比如生长因子、外泌体等。由此可见干细胞上清中成分非常复杂。

成   分（不同培养体系成分不同）

培养基：包括碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等

细胞因子：干细胞分泌的具有广泛生物学活性的小分子蛋白质

外泌体：干细胞分泌的一种纳米囊泡物质，携带多种功能性蛋白质和遗传信息，如核酸、蛋白质、脂质等

生长因子：促进细胞生长和增殖的蛋白质，如表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）等。

其他成分：可能包括氨基酸、核苷酸、抗氧化剂等，这些都是细胞生长和功能维持所必需的

干细胞上清工艺：通常是在细胞生长到80%汇合，将培养基轻轻吸出。收集的上清液需要经过过滤或离心，以去除细胞碎片和大的细胞团块。离心或过滤后即获得了干细胞上清。如果有其他需求可以再通过超滤或其他方法进行浓缩，以提高其中生物活性物质的浓度。浓缩后的上清液可以进行冻干处理，制成冻干粉，以便于长期保存和后续应用。

研究节选

MSC培养上清液处理后显着提高了我们体外慢性伤口模型中成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞的存活率。同时研究对比了体外环境中，MSC细胞和MSC培养上清对成纤维细胞增殖的影响，发现培养上清更有助于促进成纤维细胞增殖。这可能预示干细胞培养上清着对于慢性伤口或难愈合伤口治疗中比单独移植干细胞更有效[1]。还有一项研究证明了MSC培养上清对糖尿病伤口有明显优势（动物实验研究）[2]，如图1。

图1：对照组（DC）不接受任何治疗；安慰剂组（DP）接受普通培养基（DMEM）；糖尿病条件培养基组（DCM）接受人间充质干细胞条件培养基（hBM-MSC-CM）的治疗。

研究另一项研究表明，MSC培养上清，心脏成纤维细胞（HCF）进行辐照，然后用脐带间充质干细胞UC-MSCs 的条件培养基（MSCCM）培养，发现MSCCM 促进细胞活力，减少胶原蛋白沉积，防止氧化应激和增加抗氧化状态，并降低促纤维化 TGF-β1、IL-6 和 IL-8 水平[3]，如图2：

图2：A通过 CCK8 分析细胞活力。比较对照细胞（Control）、单次照射 HCF 细胞（Ir）、照射 + MSCCM 处理的 HCF 细胞（Ir+MSCCM）、照射 + MRCCM 处理的 HCF 细胞（Ir+MRCCM）、照射 + NF-κB 抑制剂处理的 HCF 细胞（Ir + NF-κB 抑制剂） 和照射 + TβRI 抑制剂处理的 HCF 细胞 （Ir + TβRI 抑制剂）B/C分析胶原蛋白含量；D分析氧化应激和抗氧化水平。

小仙的画外音：干细胞上清液目前能看到的文章不多，大多集中在皮肤修复，抗老方面，很少看到直接注射的文章，小仙认为是因为其成分复杂，如果要直接注射的话，要考虑过敏因素，另外因为成分复杂，其成分和培养体系有关，如果用于申报也很有难度。

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干细胞裂解液（不同干细胞裂解液成分不同）

干细胞裂解液是通过破坏细胞膜和细胞器，释放细胞内容物，包括蛋白质、核酸、细胞器等，从而获得的液体。

成分（可能包括但不限于）

细胞结构蛋白、酶、受体、转录因子、DNA和RNA、细胞器的碎片

生长因子：如干细胞分泌的各种生长因子

细胞代谢产物：细胞在代谢过程中产生的各种小分子物质。

干细胞裂解液工艺：利用超声波的能量破坏细胞，这种方法能够高效地裂解细胞，但需要控制超声的强度和时间，以避免过度裂解导致细胞内容物的降解；还可以通过反复冷冻和融化细胞，利用冰晶的形成和融化过程中的渗透压变化来破坏细胞膜，这种方法较为温和，但可能需要较长的时间来实现细胞的完全裂解。还有一种化学裂解法，即使用特定的裂解液，其中可能包含去垢剂（如SDS、NP-40、Triton X-100）、盐、缓冲液、蛋白酶抑制剂等成分，以促进细胞膜的破坏和蛋白质的溶解。但这样要考虑添加的裂解液对后续使用的影响。

干细胞裂解液有研究证明与细胞移植相比，来自人脂肪来源的 MSC 裂解物在高脂饮食小鼠的葡萄糖耐量方面有相当的改善[4]。因为由于超重和胰岛素抵抗被认为是衰老过程的并发症，这使得研究者推断可能使用脂肪来源的MSC裂解物进行抗衰老干预。但事与愿违，大鼠从12个月龄开始接受终生脂肪间充质干细胞裂解物治疗，雌鼠和雄鼠都现了寿命缩短的趋势[5]。如图3：

图3

小仙的画外音：干细胞裂解液成分也非常多，但是好在都是细胞胞内物质，不存在外在的培养基成分，目前市场使用经常用来局部注射，但是能看到的注射方式的研究也非常少。

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干细胞外泌体（每种细胞都有外泌体）

干细胞外泌体是一类直径在30-150纳米的微小囊泡，由细胞主动分泌并释放到细胞外，具有双层脂质膜结构。它们在细胞间的物质和信息传递中起着重要作用，含有丰富的miRNA，目前来说研究非常多。详细文章见[全系列]外泌体文章荟萃

外泌体大小：直径约30-150nm

微囊泡大小：直径为100nm-1μm

从研究上来讲，并不严格区分外泌体（exosomes）或微囊泡（microvesicles）。

外泌体数量：人体中大约有10*14个，平均每个细胞产生1000-10000个

成  分

蛋白质：外泌体包含母细胞特征性的生物信息分子，如蛋白、脂质、DNA、mRNA、miRNA以及Non-coding RNA等。外泌体表面标记蛋白主要有Alix，TSG101，CD63，CD9，CD81和HSP70。

脂质：外泌体的膜上胆固醇和二酰甘油含量较高，这些脂质在维持外泌体结构和功能中起到关键作用。

核酸：包括DNA、mRNA、miRNA等，这些核酸分子可以被转运到受体细胞，参与细胞间的信息传递和基因表达调控。

代谢物：外泌体还可能包含细胞的代谢产物，这些物质可以反映细胞的代谢状态和功能。

有人总结过，外泌体提取方法包括：超速离心法、基于尺寸大小的技术、免疫吸附的分离技术、沉淀法、基于微流控的分离技术。

超速离心法是分离外泌体的标准方法。在4℃条件下依次以300G，2000G，10000G的转速离心，依次去除细胞和细胞碎片等，再以100000G超速离心得到外泌体。但离心法每次处理的样本量较小，而且反复高速离心会导致外泌体破裂影响质量。

几乎所有细胞都可以释放外泌体。如果这个外泌体是间充质干细胞分泌的，我们就叫间充质干细胞外泌体（MSC-exo）。MSC-exo表达所有外泌体共同表达的相关标志物：细胞骨架蛋白质（微管蛋白和肌动蛋白），同时也表达MSCs的表面标志物（如CD90、CD73）。

各种组织来源的MSC-exo

干细胞外泌体的研究非常多。主要基于它本身的作用包括：促进组织修复和再生、免疫调节、抗炎作用、神经保护和神经再生、抗纤维化、药物递送、基因调节、血管生成促进和细胞通讯等。

一篇综述详细介绍了间充质干细胞外泌体（MSC-Exos）与传统技术和干细胞疗法在骨关节炎相比的优势所在，如图4。

图4

MSC-Exos主要依靠旁分泌机制来实现其治疗效果。这意味着它们分泌不同的生物活性分子，包括生长因子、细胞因子和信号分子，这些分子可以改变靶细胞和组织的功能。通过这种旁分泌方法，可以规避基于细胞的治疗的危险，如免疫排斥、肿瘤形成和不受控制的分化。外泌体无需细胞移植即可分离、表征和给药，使其成为一种更容易获得且可能更安全的治疗选择。MSC-Exos在临床前和早期临床研究中显示出良好的安全性[6]。大量实验研究提供了MSC-Exos治疗阿尔茨海默病、帕金森病、创伤后和缺血性脑损伤、精神分裂症和自闭症谱系障碍（ASD）的有益作用的证据，足以说明间充质干细胞来源的外泌体可以作为治疗神经认知障碍的新疗法[7]。也有利用外泌体的载药能力开展的研究，研究者利用脂肪间充质干细胞载SAV-siRNA，将这种siRNA递送到心肌细胞中，以诱导心肌细胞更新，证明了这种方法可作为心肌梗死治疗手段[8]。

除了MSC来源的外泌体，有一项研究介绍了诱导多能干细胞诱导（iPSC）的神经干细胞（NSC）分泌的外泌体在伤口愈合中的作用。结果证明了这种外泌体能够在体外促进血管内皮细胞的管形成，在体内能促进小鼠伤口愈合[9]。

图5

另一项研究研究了iPSC的外泌体对老年人真皮成纤维细胞（HDF）的影响。通过 MTT 测定测定细胞增殖和活力，通过划痕测定和transwell迁移测定显示细胞迁移能力。为了诱导光老化和自然衰老，HDF分别用UVB（315 nm）照射和传代培养超过30代。结果发现来自人 iPSC 的外泌体（iPSCs-Exo）在正常条件下刺激HDFs的增殖和迁移。iPSCs-Exo预处理抑制了UVB照射引起的HDFs损伤和基质降解酶（MMP-1/3）的过表达。这些结果表明 iPSCs-Exo在治疗皮肤衰老方面具有治疗潜力[10]。

截止到24年10月27日，在clinicaltrials.gov上登记的用干细胞来源的外泌体进行的临床研究有45项，其中中国有13项，具体如下表1：

表1：中国在clinicaltrials注册的干细胞来源外泌体临床试验

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小黑板

1）干细胞上清液、干细胞裂解液、干细胞外泌体不是干细胞，只是来源于干细胞或者说来源于干细胞培养过程，可以成为干细胞衍生品。

2）就这三种干细胞衍生物来说目前从治疗机制，产品工艺等方面来看，最容易成药的应该还是干细胞外泌体。

3）无论市面上多少种说法，技术的底层逻辑是永远不会改变的，消费者多问多听多看才能正知正见，行业从业者也应该遵守技术本质，减少过多的市场包装才能走的长久。

参考文献

Kraskiewicz H, Paprocka M, Bielawska-Pohl A, Krawczenko A, Panek K, Kaczyńska J, Szyposzyńska A, Psurski M, Kuropka P, Klimczak A. Can supernatant from immortalized adipose tissue MSC 

replace cell therapy? An in vitro study in chronic wounds model. Stem Cell Res Ther. 2020 Jan 21;11(1):29. doi: 10.1186/s13287-020-1558-5. PMID: 31964417; PMCID: PMC6975034.

Saheli M, Bayat M, Ganji R, Hendudari F, Kheirjou R, Pakzad M, Najar B, Piryaei A. Human mesenchymal stem cells-conditioned medium improves diabetic wound healing mainly through modulating fibroblast behaviors. Arch Dermatol Res. 2020 Jul;312(5):325-336. doi: 10.1007/s00403-019-02016-6. Epub 2019 Nov 30. PMID: 31786709.

Chen ZY, Hu YY, Hu XF, Cheng LX. The conditioned medium of human mesenchymal stromal cells reduces irradiation-induced damage in cardiac fibroblast cells. J Radiat Res. 2018 Sep 1;59(5):555-564. doi: 10.1093/jrr/rry048. PMID: 30010837; PMCID: PMC6151644.

Lee CW, Hsiao WT, Lee OK. Mesenchymal stromal cell-based therapies reduce obesity and metabolic syndromes induced by a high-fat diet. Transl Res. 2017 Apr;182:61-74.e8. doi: 10.1016/j.trsl.2016.11.003. Epub 2016 Nov 12. PMID: 27908750.

Hsu MF, Yu SH, Chuang SJ, Kuo TK, Singal PK, Huang CY, Kao CL, Kuo CH. Can mesenchymal stem cell lysate reverse aging? Aging (Albany NY). 2018 Oct 24;10(10):2900-2910. doi: 10.18632/aging.101595. PMID: 30362957; PMCID: PMC6224235.

Vadhan A, Gupta T, Hsu WL. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes as a Treatment Option for Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2024 Aug 23;25(17):9149. doi: 10.3390/ijms25179149. PMID: 39273098; PMCID: PMC11395657.

Harrell CR, Volarevic A, Djonov V, Volarevic V. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes as New Remedy for the Treatment of Neurocognitive Disorders. Int J Mol Sci. 2021 Feb 1;22(3):1433. doi: 10.3390/ijms22031433. PMID: 33535376; PMCID: PMC7867043.

Bai W, Zhu T, Zuo J, Li Y, Huang X, Li G. Delivery of SAV-siRNA via Exosomes from Adipose-Derived Stem Cells for the Treatment of Myocardial Infarction. Tissue Eng Regen Med. 2023 Dec;20(7):1063-1077. doi: 10.1007/s13770-023-00588-z. Epub 2023 Oct 6. PMID: 37801227; PMCID: PMC10645647.

Li J, Gao H, Xiong Y, Wang L, Zhang H, He F, Zhao J, Liu S, Gao L, Guo Y, Deng W. Enhancing Cutaneous Wound Healing Based on Human Induced Neural Stem Cell-derived Exosomes. Int J Nanomedicine. 2022 Dec 5;17:5991-6006. doi: 10.2147/IJN.S377502. PMID: 36506346; PMCID: PMC9733565.

Oh M, Lee J, Kim YJ, Rhee WJ, Park JH. Exosomes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Ameliorate the Aging of Skin Fibroblasts. Int J Mol Sci. 2018 Jun 9;19(6):1715. doi: 10.3390/ijms19061715. PMID: 29890746; PMCID: PMC6032439.

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