蒽环类化疗药物对多种肿瘤有效，其用于治疗白血病、淋巴瘤和其他实体瘤，大大提高了患者的生存率。然而，蒽环类药物【如阿霉素（DOX）】与心脏毒性有关，可表现为心肌细胞肥大，进展为心肌病，最终发展到心力衰竭。如果在不可逆心脏损害发作前检测到心脏损伤，则可缓解该风险。
糖蛋白（P-gp）是一种ATP结合盒转运体，作为药物外排泵，减少心肌细胞内有害物质的积累，如药物代谢产物（抗癌药物）和炎症介质，从而保护细胞免受毒性物质损害。心肌损伤时，P-糖蛋白的表达和功能对于保护心肌细胞和调节药物疗效具有重要意义，但关于P-糖蛋白的具体底物和其在心肌损伤中的详细作用机制仍需进一步研究。
目前肿瘤心脏病学中心脏成像的金标准是超声心动检查，但超声检查无法在分子阶段早期检测心脏损伤，因此在分子水平早期检测化疗药物引起的心脏毒性至关重要。多项研究表明正电子发射断层扫描（PET）可在亚临床阶段定量检测抗癌药物引起的心脏毒性。因此，今天小编要分享的一篇文献是关于68Ga标记的Galmydar（一种定位于心肌细胞线粒体的P-糖蛋白底物）在阿霉素治疗引起的心脏毒性中的无创性检测效能。接下来，就跟小编一起来看看本项研究的主要发现吧！
研究者以Sprague-Dawley大鼠为实验模型，实验组（n=3）予以DOX治疗（15mg/kg），而对照组（n=3）在同等条件下注射生理盐水，治疗5天后进行PET/CT显像。注射放射性药物68Ga-Galmydar 60min后进行静态扫描（10min），在心脏区域勾画ROI，计算心肌SUV（定义为平均放射性活度/体重/注射剂量）。
实验结果表明与对照组相比，实验组大鼠心脏摄取明显减低。实验组大鼠心肌摄取平均SUV为0.92，对照组大鼠心肌摄取平均SUV为1.76，对照组心肌摄取为实验组的1.91倍（图1）。随后的离体器官生物分布实验也证实了这一结果，DOX治疗后的实验组大鼠心脏摄取较对照组更低，实验组大鼠（n = 3）心肌摄取为0.44 ± 0.1 %ID/ g，而对照组大鼠（n = 3）心肌摄取为0.89 ± 0.03 %ID/ g（p = 0.04）。详细数据见（图2）。
图1. (A)大鼠micro-PET/CT成像。
图A上图为对照组大鼠心脏摄取的轴位、冠状位及矢状位图像；图A上图为实验组DOX治疗后大鼠心脏摄取的轴位、冠状位及矢状位图像。
(B)两组大鼠心脏摄取的定量柱状图。实验组大鼠心肌摄取明显低于对照组（实验组大鼠心肌摄取平均SUV为0.92，对照组大鼠心肌摄取平均SUV为1.76，实验组SUV:对照组SUV=1：1.91，n=3）。
图2.两组大鼠注射68Ga-Galmydar后离体器官生物分布数据（%ID/g）。
采用Wilcoxon两样本实验获得每个器官摄取的p值（大脑：z = 1.75，p = 0.07；血液：z = 1.74，p = 0.04；脂肪：z = 1.31，p = 0.10；心脏：z = 1.75，p = 0.04；肺：z = 0.44，p = 0.34；肌肉：z = 1.31，p = 0.10）。
Galmydar是一种荧光分子（Eex：375 nm，Eemis = 485 nm），于是研究进一步利用大鼠心肌细胞（H9c2）进行68Ga-Galmydar放射性及荧光实验。
首先研究者进行活细胞荧光成像评估不同浓度DOX处理后H9c2细胞摄取Galmydar的程度。H9c2细胞在含不同浓度的DOX（1 μg/mL, 5 μg/mL, 和10 μg/mL）的培养基中孵育24h（37℃，5%C02），随后更换新鲜培养基，然后在与Galmydar（20 μM）孵育1h（37℃，5%C02）。实验结果表明随着DOX浓度加大，H9c2细胞摄取Galmydar逐渐减少（图3），H9c2细胞摄取Galmydar呈DOX剂量负性依赖性。
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图3.DOX诱导大鼠心肌细胞发生心肌病。
用DOX（0、1、5和10 μg/mL）处理H9c2细胞24h后，用荧光成像法检测Galmydar（20 μM，60 min）的摄取情况。随着DOX浓度加大，H9c2细胞摄取Galmydar逐渐减少。其中探针积累随着DOX剂量的增加而减少（1μg/mL DOX处理时下降1.0倍，5 μg/mL DOX处理时下降1.3倍，10μg/mL DOX处理时下降5.2倍（H=9.45，p = 0.02）。
进一步评估Galmydar（20 μM）的时间摄取动力学函数变化，进行DOX（10）或无DOX共孵育5h的H9c2细胞荧光成像，研究结果表明随着时间增加，与对照组相比DOX处理组H9c2细胞摄取及存留Galmydar逐渐减少（图4）。既往研究发现DOX治疗可以改变线粒体氧化还原电位，从而使线粒体去极化，并在30分钟内提高基质Ca2+和ROS的产生。因此实验结果也证实探针摄取程度与线粒体电位去极化相平行。
5h后，DOX处理组大鼠心肌摄取探针降低，对照组小鼠心肌摄取为实验组的8.2倍（p=0.09）。
此外，线粒体中DOX的还原导致其半醌形式的产生，它与铁、氧和过氧化氢反应产生ROS。为了评估dox处理的H9c2细胞中ROS的产生是否确实由超氧化物的产生介导，研究进行了活细胞成像，并定量了荧光信号。DOX治疗4-6h后，H9c2细胞中MitoSox（一种验证良好的荧光探针，可用于监测线粒体中超氧化物的产生）信号增强了1.5-2.6倍（图5），这也证明了Galmydar摄取与一种与线粒体中超氧化物的产生相一致的时间依赖性的药理反应。
H9c2细胞用DOX（1μg/mL）在37˚C下处理60 min，用PBS清洗2次，用新鲜培养基培养，用MitoSox（0.5μM）在37˚C下孵育15 min，并使用荧光成像分析细胞内摄取。研究结果表明DOX治疗后MitoSox信号增强了1.5-2.6倍。
值得注意的是，孵育1小时后线粒体电位去极化使Galmydar的保留明显减少（图4），但处理3小时后才观察到超氧化物的产生（图5），这表明在这些条件下线粒体去极化先于超氧化物的产生。
线粒体通过形成线粒体通透性过渡孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）来应对这种过度的氧化应激、去极化和改变的氧化还原状态。MPTP允许细胞色素c泄漏，从而引发级联反应，导致效应caspase-3的激活，从而诱导细胞凋亡。为了评估Galmydar成像是否提供了在线粒体开始去极化时诱导凋亡通路的上游通路，我们还进行了流式细胞仪分析。
在增加阿霉素剂量治疗后，流式细胞术显示caspase-3激活增加，与荧光显微镜研究中观察到的Galmydar摄取抑制成反比。此外，caspase-3的激活在阿霉素治疗后的4天内逐渐增加，这表明Galmydar在caspase-3介导的线粒体凋亡级联效应开始之前便检测到线粒体的缺陷（图6）。68Ga-Galmydar成像可能在心肌细胞凋亡过程的早期检测出线粒体功能损伤。
图6. DOX诱导大鼠心肌细胞caspase-3活化。
用DOX（0和10 μg/mL）处理H9c2细胞1小时，新鲜培养基培养0-4天，使用流式细胞术测定Caspase-3的活度。
68Ga-Galmydar可以提供一种高特异性和高敏感性的非侵入性分子成像技术用于监测线粒体损伤，可以在早期阶段提供对DOX治疗相关和可能可逆的代谢变化的无创评估，从而使接受化疗（尤其是DOX治疗）的患者的治疗选择得以分层。
参考资料：
1.Sivapackiam, Jothilingam et al. “68Ga-Galmydar: A PET imaging tracer for noninvasive detection of Doxorubicin-induced cardiotoxicity.” PloS one vol. 14,5 e0215579. 23 May. 2019, doi:10.1371/journal.pone.0215579.
2.综合篇|小动物PET在心脏疾病方面的应用
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