生命的神奇元素——硒！

在生命体的微观世界中,每时每刻都发生着许许多多重要的代谢过程以维持生命机体的正常活动,在这个过程中,有多种活性化学成分参与。例如具有氧化功能的活性氧(ROS)、活性氮(RNS)以及具有还原作用的活性硫类分子等,而这些活性物种通常难以直接检测和观察到。于是,科学家们想到了一种间接的解决思路:将这些代谢过程中产生的活性物种转化为实验中容易检测或者能够直接观察到的信号，比如荧光,利用一类特殊功能的化合物——“荧光探针”与活性物种作用发射荧光，并检测荧光信号的变化，即可获得这些活性物种的含量等信息。在正常生理条件下，活性物种含量往往很低，这就要求荧光探针分子具有很高的敏感度。由于硒原子形成化学键的键能比同族的硫原子低，且电负性也比硫要低,含硒的低价化合物比含硫的低价化合物更容易被氧化，从而使得硒化合物对低浓度的氧化剂和还原剂具有更灵敏的响应特性。因此含硒的荧光探针可以很好地应用于上述系列活性物种的检测。

硒原子易被氧化形成Se=O键,因而在检测具有氧化功能的活性物种方面有着优异的性能。例如,过氧亚硝基(ONOO − )是一种具有高度活性的氧化剂,它是由一氧化氮和超氧化物自由基反应生成的。这一物种能够破坏许多关键的生物分子,诸如蛋白质、脂质、过渡金属酶活性中心及核酸等,从而引起多种疾病。而含硒的荧光探针1(BzSe-Cy,结构如图1A所示)，就可用于ONOO −的识别与检测。在 770 nm的激发光下,含硒探针自身会在800nm有强的荧光发射信号。当环境中有ONOO − 存在时，会引起探针中 Se原子氧化形成 Se=O键,导致其荧光强度降低。另一方面,加入还原剂抗坏血酸后，会使得荧光强度恢复。实验结果表明,在一定的浓度范围内,含硒探针的荧光强度和ONOO −的浓度呈良好的线性关系。因此,实验中可通过测量荧光强度检测ONOO −的浓度,具有重要的应用价值。

基于同种检测原理,一种具有高选择性的含硒近红外荧光探针2 被开发出来,成功应用于次氯酸的检测。该探针结构如图1B所示,在溶液中,该探针分子自身发生聚集作用,导致荧光信号很弱。而当环境中有次氯酸时,次氯酸的氧化作用使Se氧化成Se=键,探针分子由聚集状态转为分散状态,在786nm发出荧光。该探针对次氯酸具有极高的灵敏度与特异性,检测限可达0.31μmol·L −1而其他的活性氧物种不会引起荧光变化。这种高选择性的探针被成功用于小鼠体内次氯酸的检测。更有趣的是,含硒荧光探针不仅可用于检测上述氧化性活性物种,含Se―N键的荧光探针还具有模拟谷胱甘肽过氧化酶类似物Ebselen的模拟酶性质。利用Se―N键易被硫醇类的物质还原这一特点,含Se―N键荧光探针也被用于检测还原性的活性硫类物种,并表现出良好的生物相容性。2007年笔者首次报道了含硒荧光探针应用于选择性硫醇类检测的工作。在这一应用中,基于巯基的强亲核作用将Se―N键打断,从而恢复罗丹明6G的强荧光结构(图2A)。通过测定探针荧光强度的变化,实现对含巯基类物质的定量检测。

在此基础上,笔者对该含硒探针进行了改进,设计并合成了一种利用罗丹明染料螺环和开环结构变化的含Se―N键的荧光探针(Rh-Se-2)。由于螺环结构本身并无荧光,加入硫醇小分子后,巯基的强亲核作用使得结构中的Se―N键断裂,罗丹明110开环的强荧光结构恢复,且荧光增强高达170倍(图2B)。该探针成功应用于硫醇类物质的高选择性检测,而对硫醇之外的其他类型活性物种不敏感,具备很好的特异性。实验数据表明,该含硒探针在正常肝细胞中会发出强烈的荧光,而在肝癌细胞中只有微弱的荧光，因此具有很好的临床应用潜力。除上述小分子硒荧光探针之外,硒元素还可以结合纳米材料,实现上述活性物种的高效检测。例如,一种含硒的新型二氧化硅纳米颗粒荧光探针能够靶向定位于细胞里面的线粒体,实现对线粒体内H2O2和pH的同步检测。这种纳米荧光探针是通过物理吸附方法,在介孔二氧化硅的孔道中负载上含硒的荧光分子Cy-O-SeH(图3,探针5)。硒原子在 H2O2 的作用下形成Se―N 键(Cy-O-Eb),导致在794nm处的荧光增强。介孔二氧化硅纳米颗粒里负载的另一种荧光探针——荧光素,用于pH 的检测。通过二氧化硅表面修饰的线粒体定位基团三苯基膦,该纳米荧光探针靶向在细胞内的线粒体,从而实现对活细胞线粒体内的H2O2和pH的同步双检测功能。

质谱分析技术是一种基于测量离子质荷比(m/z)从而确定分子量和成分的化学分析方法。其基本原理是将样品在离子源中生成带电粒子,再将带电粒子按质荷比分离检测。它可以快速准确地测定化合物的分子量,并且具有高灵敏度、高选择性和高通量等诸多优势。因此,质谱分析在化学、化工、生物、医疗、制药、农残检测、食品安全等诸多学科和应用领域发挥着不可替代的作用。基于硒荧光探针的思路,含硒化合物在质谱检测中的应用也引起了广大科研工作者的研究兴趣。基于质谱技术,笔者探究了能够特异性快速衍生化硫醇的两种化合物依布硒啉(ebselen)和 N-(苯基硒代)邻苯二甲酰亚胺(NPSP),并通过此方法实现复杂混合物中含游离半胱氨酸残基的多肽甚至蛋白质分子的快速筛选。结合二级质谱数据,成功实现了蛋白质游离和结合的硫醇的数量及其位置的准确检测。在这基础上,设计并合成了带有6个氘原子的d6 -NPSP并应用于肝癌的标志物检测。通过LC-MS技术,分别在肝癌细胞和正常细胞中实现了谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcys)相对含量的测定,具有重要的医学应用前景。

    由于硒元素独特的化学性质,除在识别细胞内氧化还原平衡相关的各类小分子等方面发挥着重要作用外,硒元素在生物大分子研究领域也逐渐日益重要。首先,含硒类药物是药学家持续关注的研究热点。多种含硒类药物,例如谷胱甘肽过氧化物酶的模拟物依布硒啉和硫氧还蛋白还原酶抑制剂乙烷硒啉(ethaselen)等,已进入临床实验阶段 。近些年,随着质谱技术和蛋白质组学的飞速发展,一系列含硒类药物的靶向蛋白逐渐被发现和报道。其中,利用合成生物素-依布硒啉探针(Biotin-Ebselen),研发了蛋白质活性表达谱的(ABPP)检测方法(图4),用于检测依布硒啉共价靶向蛋白。利用该方法并结合定量蛋白质组学,成功鉴定出 HeLa 癌细胞蛋白组中与依布硒啉共价作用的 462种靶向蛋白,其中大部分是尚未报道过的依布硒啉靶向新蛋白。这一发现为肿瘤治疗提供了更多的潜在靶点,对依布硒啉类药物设计和临床实验具有重要的指导意义。

从一定意义上讲,蛋白质组学的飞速发展很大程度上离不开质谱技术的广泛应用。由于高通量、高灵敏度和较大的动态范围等优势,质谱分析技术已经成为蛋白质组学等一系列分子生物学相关研究中不可缺少的技术。硒元素独特之处在于其具有六个可检测到的稳定同位素(74Se,0.89%; 76Se,9.37%; 77Se,7.63%;  78Se,23.77%; 80Se,49.61%; 82Se,8.73%),在质谱分析中能产生独特的同位素分布的峰型。基于此,研究人员有针对性地引入硒标签,从而开发新的蛋白质组学方法。例如，一般肽段的主要组成元素为碳、氢、氧、氮这些蛋白性元素(proteogenic elements)。这些元素具有一个共同特点,即分别有一个同位素占据绝大多数的丰度。由它们构成的肽段都有着相似的同位素峰型分布。通过化学标记的方法在目标肽段上引入含硒标签,就能够改变原有的同位素峰型分布而形成含硒的同位素峰型,从而在质谱一级谱上特异性地将目标肽段区分开。这种识别技术具有检测不依赖于丰度的优势,只要该肽段的丰度达到了质谱的检测限,即可被检测到,避免了传统方法如鸟枪法蛋白质组(shotgun proteomics)中数据依赖型采集模式(Data Dependent Acquisition, DDA)无法对低丰度蛋白有效鉴定的缺点。2018年,王初课题组开发了名为SESTAR的质谱方法,通过特异性识别二级质谱数据中的硒同位素峰型分布来检测含硒分子(图 5)。这一方法可以有效应用于硒蛋白和硒代谢物的功能性研究,生物体内新的含硒物质的发现,含硒探针标记的化学蛋白质组学以及含硒药物的研究,对硒生物学的发展起到重要的推动作用。

另外,科研人员还将硒在质谱中具有特殊同位素峰形的优势引入到酶的活性检测中。鞠熀先课题组通过引入硒代蛋氨酸,合成含硒的多肽酶底物。与酶孵育后,依靠简单的质谱全扫描模式,通过独特的硒同位素分布特征进行酶的底物鉴定,而无需二级质谱验证。这一方法为特异性鉴定酶底物提出了新的解决方案,可以排除复杂生物样品中质量差异的微小干扰,为酶活性分析提供了更加准确数据。

硒元素在生理过程中起着重要作用,如抗氧化、抗癌、提高免疫力等,含硒的分子探针在观察生命活动、识别细胞内氧化还原平衡、研究生物大分子功能等方面也发挥着重要的作用。