Nat Aging｜用富含多酚的天然提取物靶向年龄或化疗引起的衰老，可以改善小鼠的寿命和健康状况

科技 2024-10-11 21:46 上海

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翻译｜吴秋萍

编辑｜木朵

/ 摘要 /

组织内衰老细胞的积累会促进衰老和年龄相关疾病的进展。富含植物成分的植物提取物为发现针对衰老的治疗方法提供了有用的资源，从而改善健康。在这里，我们通过实验证明，每天口服一种标准化的鼠尾草提取物（Haenkenium（HK））延长了自然年龄小鼠的寿命和健康寿命。HK治疗抑制多个组织中年龄诱导的炎症、纤维化和衰老标志物，并与年龄匹配对照相比增加了小鼠的肌肉强度和毛皮厚度。使用P16Luc报告小鼠，我们还发现，HK治疗可减少化疗剂阿霉素急性诱导的衰老。我们通过质谱分析了HK的成分，并将木犀草素（HK中最浓缩的类黄酮）鉴定为senomorphic（注解：senomorphics 疗法的原理是破坏衰老的主要属性，主要是 SASP 的产生和分泌）化合物。机理上讲，通过进行表面等离子体共振和原位i邻位连接技术连接测定，我们发现木犀草素破坏了P16-CDK6相互作用。这项研究表明，施用HK可延长小鼠寿命，其机制可能是通过调节细胞衰老和破坏p16-CDK6相互作用实现的。

引言

在高收入国家，预期寿命增加和出生率降低导致人口老龄化¹。老龄化与癌症、心血管疾病、代谢疾病、肾脏疾病和神经退行性疾病等年龄相关疾病的增加有关，这些疾病是全世界死亡的主要原因^2-4。这导致老年人生活质量下降，医疗支出增加，从而造成社会和经济负担。因此，老龄化领域的当前研究侧重于改善健康寿命（即，一个人健康状况良好的年数）而不是总寿命²。现在人们普遍认为，整体性地治疗衰老，而不仅仅是治疗单一衰老相关疾病，可能是治疗与年龄相关疾病和提高老年人健康水平的更具影响力的策略⁶。体内衰老细胞的积累是生物体衰老的主要因素^7,8。细胞衰老，定义为细胞分裂的稳定停止，可由外源性细胞损伤（如DNA损伤剂）、紫外线（UV）照射或内源性细胞应激源（如年龄相关端粒损耗或癌基因表达）触发。衰老的特征是细胞周期抑制剂（如P16INK4A（P16））的上调，其破坏细胞周期的从G1至S期的转变⁹。P16抑制CDK4和CDK6的激酶活性，防止Rb的过度磷酸化和E2F9的释放。尽管衰老细胞不能进行细胞周期进展，但它们在组织内的积累通过分泌多种炎症因子（统称为衰老相关分泌表型（SASP））导致与年龄相关的退化¹⁰。SASP释放对组织微环境的破坏可以通过以旁分泌和系统方式驱动衰老细胞积累来加速衰老⁴。

已经有研究证明，选择性去除衰老细胞可以延长寿命，恢复老年动物的健康范围^11-15。植物提取物长期以来一直在土著、传统或民间医学中用于治疗与年龄相关的疾病。一个不断扩大的研究机构已经确定了具有假定抗衰老特性的植物化学成分（例如，多酚、类黄酮、萜类）。植物源性营养素已被描述为通过Nrf2介导的抗氧化防御诱导、有丝分裂激活、sirtuin诱导或mTOR和蛋白质翻译抑制等机制延长健康寿命^19-23。

通过对3065种植物、海洋和合成化合物进行高通量筛选，我们在先前鉴定了一种在体外可延迟衰老的玻利维亚燕麦鼠尾草（Salvia haenkei（SH））提取物²⁴。使用不同的体外小鼠和人类模型的实验显示SH显著减少了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞的数量²⁴。当Senolytic（抗老杀灭）化合物选择性杀死衰老细胞以促进改善的有机体健康时，SH显示了Senomorphic特性。Senomorphic化合物（也被称为senostatics/回春剂）调节衰老细胞的功能和形态，将功能恢复到与年轻细胞相似的水平，或延迟组织中衰老细胞的积累²⁵。SH还显示出通过上调多种因素，如紧密连接蛋白、聚丝蛋白和SIRT1，促进伤口愈合，防止活性氧物种（ROS）的形成和延迟Hacat细胞中的常见衰老表型形成（参考文献26）。

在本研究中，我们测试了标准化HS提取物（称为Haenkenium（HK））的体内抗衰老潜力。我们研究报告指出，每天在饮用水中用低剂量HK治疗自然衰老小鼠，可减少衰老细胞的累积，并减少多种衰老相关参数，包括寿命、身体健康、纤维化、骨矿化和炎症。HK治疗还通过治疗诱导的衰老（TIS）减少小鼠衰老。我们表征了HK的化学成分，并将膳食黄酮木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸确定为HK植物复合物中的假定活性化合物。木犀草素先前已在文献中鉴定，可以促进不同模型的抗氧化和抗炎作用^21,27。在目前的研究中，我们提出了一种机制，黄酮木犀草素通过破坏p16-CDK6相互作用实现衰老抑制，这可能可用于未来治疗的发展。

结果

HK延长小鼠的健康寿命和总寿命

为了评估HS对体内寿命的影响，我们使用了一种参考HK28的标准化植物提取物，该提取物在20个月龄开始至寿命结束时（0.5 mg kg⁻¹体重）饮用水中给衰老小鼠服用（图1A）。HK治疗动物的平均寿命为32.25个月，而未治疗组为28个月（图1b，c）。在雌性和雄性小鼠中，我们观察到显著的寿命延长，因此表明HK治疗的效果与性别无关（扩展数据图1A-C）。小鼠被安置在三个不同的动物设施中，因此在增加我们发现的繁殖性和普遍性的同时，可使偏差最小化（图1A、扩展数据图1D和补充表1）。在这些实验中，两种控制和HK治疗小鼠都可以随意使用相同的食物。因此，HK小鼠存活率的提高不是控制动物存活率低、饮食或住房条件差异的结果。根据治疗动物皮肤、肝脏、肾脏和肺部的组织病理学评估，HK给药是安全的，治疗不会导致造血参数或器官毒性的改变（扩展数据图1E，F）。此外，与对照组相比，HK治疗并未诱导胰岛素或葡萄糖注射后葡萄糖浓度的变化、每日平均水摄入量的变化或雄性和雌性小鼠精益和脂肪质量的变化（扩展数据图1g-j）。

图1.HK延长了小鼠的健康寿命和总寿命。a、实验设计的示意图。b、治疗组和未治疗小鼠的寿命分析；n=每组测试的小鼠数量；百分比变化是相对于未经处理的对照小鼠计算的。c、未治疗（n=37）和治疗组（n=48）小鼠的存活曲线。d、未治疗（UT）和治疗组（T）动物的机体表现评分进展（UT n=37；T n=48）。e、毛发状态的量化评估分数（0-3，其中0表示毛发密集，3表示毛发较薄（UT n=27；T n=46；治疗持续4个月）。f、 24个月大的未经治疗或HK治疗组的小鼠的代表性图片。g、 24个月大动物皮肤H&E染色的代表性图片。插图显示了虚线框的放大图像。h、 24个月龄未经治疗或HK治疗组的小鼠（n=6）切片毛囊直径的定量。i、 j，治疗4个月后，幼年（4个月大）和24个月大动物的股骨的骨组织百分比（i）和骨矿物质密度（j）（骨组织百分比，年轻组n=6；UT n=8；T n=8。骨密度，青年n=6；UT n=7；T n=8）。k、蛋白多糖损失的量化（年轻组 n=8；UT n=12；T n=12）。l、 OARSI评分量化（年轻组 n=8；UT n=10；T n=12）。m、用于检测幼年（4个月大）、24个月大的未治疗和24个月龄的治疗动物在治疗4个月后富含蛋白多糖的软骨番红素染色的代表性图像（上图放大10倍，下图（上图虚线框所示区域）放大40倍）。n、治疗4个月后，对年轻（3个月）和年老（24个月）动物进行握力测定的结果（年轻n=10，UT n=5，T n=9）。o、胫骨肌纤维CSA的定量（年轻组 n=7；UT n=16、T n=15）。p、年轻组（4个月大）、24个月龄未经治疗或24个月龄HK治疗组的小鼠在治疗4个月后胫骨肌切片的代表性图片，带有肌营养不良蛋白免疫荧光染色。q、年轻组（4个月大）、24个月龄未治疗和24个月龄治疗组治疗4个月后动物肾脏切片H&E染色的代表性图片。插图显示了虚线框的放大图像。r、肾小球直径的定量（年轻组 n = 7; UT n = 6; T n = 6）。S、4个月龄、24个月龄未治疗和24个月龄治疗动物肾部分PSR染色的代表性图片。插入显示虚线框的放大图像。T、肾切片纤维化区百分比的定量（年轻组 n= 6；Ut n= 5；T n= 9）。U、FN1、COL1A1和COL3A1的肾mRNA表达（每个点代表不同的动物；年轻组n= 8，Utn= 10，tn= 14）。以d、h、i、j、k、l、n、o、r、t和u表示的数据以平均±s.e.m.表示。b和c中使用的统计检验：对数秩检验。e、h和j中使用的统计检验：双尾不匹配t检验。i、k、l、n、r、t和u中使用的统计检验：Holm–Šidák多重比较检验的单向方差分析。o中使用的统计检验：Kruskal–Wallis检验与Dunn的多重比较检验*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；***P<0.0001；NS，差异不显著。在源数据文件中可找到精确的p值。

衰老是一组复杂的系统性变化，在表型水平可检测出⁷，这些变化在生物体寿命期间逐渐累积，包括物理外观的变化。为了更好地表征HK对治疗小鼠健康范围的影响，我们开发了一个多参数评分-物理外观评分-包括实验小鼠毛皮状况、囊肿、眼部白内障和明显肿瘤存在的体内评估。评估参数表明，与未治疗组相比，HK治疗动物的年龄相关表型严重性随着时间的推移有所降低，这是在动物设施中观察到的效果（图1d和扩展数据图1k，l）。这种效应在囊肿、肿瘤发育和动物毛皮状况中尤其明显（图1e，f和扩展数据图1m，n）。总之，这些结果表明，HK增加了小鼠的健康寿命和总寿命，没有观察到毒性。

HK治疗改善多个组织的衰老表型

与对照组相比，HK治疗改善了雄性性和雌性小鼠毛皮的外观（图1e，f）。毛发和脱发与毛囊小型化有关，毛囊变化是一种常见的表型29-31。我们试图了解HK是否能够对抗这种表型。根据HK治疗组毛囊直径的测量，苏木精和伊红（H&E）在皮肤组织上的染色结果，显示毛囊小型化显著改善（图1g，h）。

由于肌肉骨骼脆弱性是老年受试的一个关键问题³²，我们研究了HK治疗对动物骨骼、关节和肌肉健康的影响。通过显微计算机断层扫描和组织学进行的骨结构分析显示，HK治疗使24个月龄小鼠股骨骨骨矿物密度（BMD）增加（图1i，j），膝软骨年龄驱动的退化性变化减少，如H&E和藏红花染色所测定显示的（图1k-m和扩展数据图2a）。接下来，我们评估了未经治疗或用HK治疗的年轻和老年小鼠的前肢握力强度。与年轻的对应组相比，老年动物表现出握力降低，HK治疗显著改善了老年小鼠的握力损失（图1n）。此外，我们发现，与年轻小鼠相比，老年小鼠肌纤维交叉区（CSA）显著降低，根据肌营养不良蛋白和胫骨前肌4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的免疫荧光确定，HK治疗有改善的趋势（图1o，p）。

衰老过程通常导致肾功能下降³³。在这方面，来自治疗小鼠的石蜡嵌入肾组织的H&E染色显示肾小球直径减少到与年轻小鼠相当的水平（图1q，r）。一只24个月大的小鼠的肾显示鲍曼胶囊的大小增加，这是一种通过测量肾小球直径确定的肾衰老的既定变化^34,35。HK治疗减轻了这种影响。此外，通过天狼星红（PSR）染色和细胞外基质蛋白（如胶原（COL1A1、COL3A1）和纤维连接蛋白（FN1）的逆转录实时定量PCR（RT-qPCR）分析检测到，HK治疗小鼠显示肾纤维化与未治疗小鼠相比出现标记性下降（图1s-u）³⁶。HK治疗还降低了与肾脏疾病相关的几种循环血清标志物的水平，如胱他汀C37（扩展数据图2b）。对年轻、老年未经治疗和老年治疗小鼠肾裂解物的蛋白质组谱分析还显示，用HK治疗分别逆转了与炎症和肾损伤相关的戊环素-2/SAP和脂内酯-2/NGAL两种蛋白质的年龄相关性增加^38,39（扩展数据图2c，d）。综上所述，这些数据表明，老年小鼠的HK治疗可在体内减少多种年龄相关表型，如脱发、肌肉骨骼脆弱性和肾纤维化。

HK对衰老相关分子通路的影响

为了评估HK影响细胞功能以延长体内寿命的机制，我们对接受治疗的小鼠腓肠肌进行了大体积RNA测序（RNA-seq）（图2a）。通过使用DESeq2，我们首先对老年动物和年轻动物的肌肉特异性转录组进行了差异表达分析，以得出衰老特征。这种衰老特征包括通过比较老年小鼠和年轻小鼠上调或下调的差异表达基因（DEG）。接下来，我们使用这种衰老特征来研究HK治疗的小鼠肌肉中发生的转录扰动，并与年龄匹配的成年未治疗对照组（24个月大的小鼠）进行比较。首先，我们鉴定了衰老过程中上调（338 DEGs）或下调（109 DEGs）的基因，发现在衰老小鼠中上调的基因在HK治疗的小鼠会下调，反之亦然（图2b）。在这些基因中，我们发现了一组主要的基因，与年轻小鼠相比，老年未经治疗的小鼠上调了这些基因（图2c）。值得注意的是，在衰老过程中上调的基因簇在与炎症、免疫激活和衰老或SASP相关的通路特征中过度表达，包括最近描述的SAUL_SEN_MAYO基因集⁴⁰。随后，与未经治疗的小鼠相比，HK治疗显著降低了衰老特征（图2d和补充表2）。

图2.HK部分逆转小鼠肌肉中与年龄相关的基因表达特征。a、批量RNA序列实验的实验设计。从年轻组（4个月大）、未治疗组（24个月大）和治疗组（24个月中，4个月治疗）动物（年轻组n=8，Ut n=10，T n=10）的胃肠肌中提取总RNA。b、条形图代表了HK治疗的衰老动物和年龄匹配对照之间的GSEA结果。测试的基因集是通过衰老动物和年轻对照之间的差异表达获得的（错误发现率（FDR）<0.05，log₂（FC）<-1或>1）。Barplots表明HK对年龄诱导的肌肉组织破坏具有显著的抗性。c、d，蛋白质-蛋白质相互作用网络，包括DEG（FDR<0.05，log₂（FC）<-1或>1），根据衰老小鼠肌肉组织与年轻对应物的比较（c）或HK治疗的衰老动物与年龄匹配对照组的比较确定（d），显示了衰老中最受调节基因的特写视图。c中的过度代表性分析表明，衰老肌肉中的基因集显著上调。

我们对这些结果很感兴趣，随之对腓肠肌整个序列中与衰老有关的其他通路进行了额外的分析。除了衰老基因集SAUL_SEN_MAYO外，我们还通过对手动挑选的基因集进行基因集富集分析（GSEA）来评估其他与衰老相关的通路，包括营养感应、蛋白质失活、干细胞维持、线粒体生物合成、端粒长度、基因组不稳定性和表观遗传变化等。其中，我们发现HK治疗下调了SAUL_SEN_MAYO（扩展数据图3a，b）。相反，HK治疗不影响营养感知、蛋白稳态丧失、干细胞维持、线粒体生物合成、端粒长度、基因组不稳定性和表观遗传变化（扩展数据图3a、b和补充表3）。

此外，我们通过蛋白质印迹分析检查了各种细胞程序，包括未折叠的蛋白质反应（通过p-eIF2α水平评估）、营养感应（通过p-4EBP1和pS6水平评估），自噬（通过LC3A/B I和LC3A/B/II水平测量）和线粒体健康（通过PGC1α水平确定）。根据我们的转录组学评估，这些被研究细胞程序都没有因衰老或随后的HK治疗而出现干扰（扩展数据图3c）。总之，我们的数据显示，HK治疗调节了与炎症和衰老相关的腓肠肌衰老的转录组特征。

HK治疗对衰老的抑制作用

我们通过对肌肉样本进行RT-PCR，证实了我们对肌肉衰老特征下调的发现，揭示了HK治疗降低了Cdkn1a和Tp53的mRNA表达（图3a）。鉴于HK下调了肌肉中与衰老相关的基因和基因集，我们探索了HK处理可以改善表型衰老的其他器官的衰老特征。因此，我们对24个月未治疗和治疗了的小鼠进行了免疫组织化学（IHC）分析，以检测不同的衰老标志物，如p16、p27、γH2AX和53BP1（参考文献41,42）。对皮肤进行的p16、p27和γH2AX的IHC染色显示，这些标志物在衰老过程中上调，而HK治疗逆转了这种表型（图3b，c）。鉴于肾脏是另一种受衰老影响的组织，我们还研究了这些标志物在肾脏中的表达。衰老标志物p16、p27和53BP1在衰老过程中显著上调，而HK治疗则使其减弱（图3d，e）。此外，由于SH的抑瘤作用之前已在体外肺成纤维细胞中显示²⁴，我们还通过IHC探索了24个月龄HK治疗小鼠肺部p27的表达，研究了其在体内的疗效。与在皮肤和肾脏中观察到的情况类似，HK治疗减轻了与年龄相关的p27水平的增加（图3f，g）。总之，这些结果表明，HK治疗降低了体内不同组织中由衰老驱动的几种衰老标志物的水平。

图3.HK改善小鼠衰老状况。a、年轻组（4个月龄）、未治疗的老年（24个月龄）和接受治疗的老年动物（24个月龄，治疗4个月）腓肠肌中Cdkn1a和Tp53的mRNA水平（幼年n=6，UT n=5，T n=5）。b、在年轻组（4个月龄）、未治疗的老年（24个月龄）和接受治疗的老年动物（24个月龄，治疗4个月）的皮肤切片上进行的p16、p27和γH2AX IHC分析的代表性图像。插图显示了虚线框的放大图像。c、不同动物皮肤切片中p16、p27和γH2AX阳性细胞的定量（每个点代表不同的动物；p16 年轻组 n=5，UT n=7，T n=6；p27年轻组n=5，UT n=4，T n=5；γH2AX年轻组n=3，UT n=4，T n=5）。d、对年轻组（4个月大）、未经治疗的老年（24个月龄）和接受治疗的老年动物（24个月龄，4个月治疗）的肾脏切片进行的p16、p27和53BP1 IHC分析的代表性图像。插图显示了虚线框的放大图像。e、不同动物肾脏切片中p16-、p27-和53BP1阳性细胞的定量（每个点代表不同的动物；p16-年轻组n=6，UT n=6，T n=6；p27年轻组n=6，UT n=10，T n=12；53BP1-年轻组 n=3，UT n=4，T n=4）。f、 p27免疫组织化学在年轻组（4个月龄）、未治疗的老年（24个月龄）动物和接受治疗的老年动物（24个月龄，治疗4个月）的肺切片上进行的代表性图片。插图显示了虚线框的放大图像。g、不同动物肺切片中p27阳性细胞的定量（每个点代表不同的动物；n=6）。a、c、e、g中的数据以平均值±标准误差表示。a、c，e和g中使用的统计检验：带Tukey多重比较检验的单因素方差分析*P<0.05**P<0.01***P<0.001****P<0.0001；NS，不显著。在源数据文件中找到精确的P值。

HK可预防阿霉素诱导的衰老和心脏毒性

除了自然衰老外，一些应激源，如化疗，也可以诱导癌症和健康组织中的衰老细胞积累⁴³。全身衰老积累是化疗和放疗（TIS）的主要副作用，它会导致癌症患者的生活质量受损¹⁰。由于HK可以缓解自然衰老小鼠的衰老，我们还假设HK可以预防TIS。出于这个原因，我们利用了阿霉素（Doxo）进行实验——阿霉素是一种用于治疗各种类型癌症的强效化学治疗剂，已知会通过引起DNA损伤和氧化应激诱导细胞衰老⁴⁴。我们在衰老报告小鼠模型p16LUC中测试了HK的疗效，其中p16的启动子控制荧光素酶报告基因的表达⁴⁵。单次注射阿霉素足以诱导衰老，如腹腔注射阿霉素7天后检测到的发光信号增加所示（图4a，b）。然而，在阿霉素给药前3天开始在饮用水中给予HK治疗（0.5mg kg⁻¹，口服灌胃）足以成功减少阿霉素治疗小鼠中p16阳性衰老细胞的积聚，并改善体重减轻（图4b，c）。

图4.HK可预防阿霉素引起的衰老和心脏毒性。a、实验设计的示意图。b、左，未经治疗和注射阿霉素的动物（20 mg kg⁻¹）中萤光素酶检测的代表性图像，有或没有HK预处理（3天，0.5 mg kg⁻¹）。在右侧，直方图FC显示相对发光强度（对照组n=4，Doxo n=3，HK+Doxo n=5）。c、注射阿霉素后2天和4天测量的动物体重减轻情况（n=3）。d、诱导心肌细胞SA-β-Gal染色的代表性图像，有Doxo（SenCMs）或没有Doxo（iCMs）处理或有100μg ml^-1 HK治疗（n=5）（左），及其定量分析（右）。插图显示了虚线框的放大图像。e、通过RTqPCR测定CDKN1A（p21）的mRNA表达（n=4）。f、 HK对SenCMs场强的影响。在不同实验条件下记录的场电位中测量的QT间期与第0天和第6天的基线（黑色痕迹）的比较示例以子集的形式显示。g、在基线、阿霉素治疗后（红线）、SenCM+HK治疗后（阿霉素+HK；绿线）和iCM经HK治疗后（UT+HK；灰线）（n=5作为不同记录的平均值）的自发搏动电活动。b、c、d、e、g中的数据以平均值±标准误差表示。b中使用的统计检验：采用Holm-Šidák多重比较检验的单因素方差分析。c中使用的统计检验：Dunnett多重比较检验的双向方差分析。d和e中进行的统计检验：采用Tukey多重比较检验的重复测量单因素方差分析。g中进行的统计检验：Doxo与Doxo+HK的双尾非配对t检验分析。*P<0.05**P<0.01。在源数据文件中可找到精确的P值。

既往研究已经将阿霉素诱导的心脏组织衰老描述为阿霉素诱导的心功能障碍的关键病理机制⁴⁶，而心脏毒性对阿霉素47的治疗用途构成了限制。如前所述⁴⁶，使用亚致死浓度（200 nM）的阿霉素治疗可导致人诱导心肌细胞（iCM）的衰老。在衰老诱导后，用HK处理iCM，如SA-β-Gal染色所示，HK显著阻止了iCM衰老（图4d），并将p21 mRNA降低到与未处理细胞相当的水平（图4e）。

阿霉素通过损害iCM中离子通道的功能来驱动心脏毒性，导致QT间期延长，这是患者致心律失常性心肌病的基础⁴⁶。我们发现，在Doxo治疗的衰老iCM（SenCM）中， Bazzett公式（QTcB）校正的QT间期显著延长（图4f，g）。HK治疗几乎完全挽救了SenCMs QTcB的延长。值得注意的事，单独使用HK不会影响对照iCM的电生理特性（图4g）。

综上所述，我们证明在化疗治疗前给予HK可以减轻化疗的有害副作用，同时保持其治疗效果。HK治疗显著减少了全身衰老的累积，预防了衰老引起的心脏毒性，最终恢复了正常的心脏功能。

HK组分木犀草素在衰老过程中对p16-CDK6的调节作用

由于HK是一种含有多种植物成分的植物提取物，我们进行了超高效液相色谱和四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）表征，以鉴定其主要成分。提取物中的三类主要分子是酚类/木脂素、黄酮类和萜类（图5a和补充表4）。然后，我们探索了每类分子中的九种成分。

图5.HK含有木犀草素，可以预防应激引起的衰老。a、上图，实验设计示意图；底部，通过UPLC-QTOF-MS对HK成分进行表征（补充表4）。b、 UV-B照射的IMR90成纤维细胞的SA-β-Gal测定定量分析，用1μM浓度或10μg ml^-1浓度的指定化合物处理HK（UV-B n=9，异槲皮素n=3，异鼠李素n=3，山奈酚n=3，木犀草素n=7，木犀草素-7-O-葡糖醛酸化合物n=4，川陈皮素n=3、松脂酚n=4，迷迭香酸n=3，二咖啡酰奎宁酸n=4，HK n=6）。c、用不同浓度的Lut（0.01-2.5μM）和HK（10μg ml^-1）处理的UV-B照射的IMR90成纤维细胞的SA-β-Gal阳性细胞的定量（UV-B，Lut 0.01μM，Lut 0.1μM，n=6；Lut 1μM，Lut 2.5μM，HK 10μg ml^-1，n=3）。d、使用或不使用Lut（0.1和1μM）或HK（1和10μg ml^-1）对Doxo处理的WI38成纤维细胞进行SA-β-Gal测定的定量（n=2）。e、用或不用Lut（1μM）或HK（100μg ml^-1）处理的Doxo处理的iCM心肌细胞的SA-β-Gal测定定量（n=4）。f、在0、15、60和360分钟时，经口灌胃给予单剂量HK（0.5 mg kg⁻¹）的小鼠的木犀草素血浆浓度（每个时间点n=3）。g、实验设计的示意图。h、肾切片SA-β-Gal染色（左）和定量（右）的代表性图片。插图显示了虚线框的放大图像。（未治疗n=3，阿霉素n=2，阿霉素+木犀草素n=3）。b、c、d、e、f和h中的数据以平均值±标准误差表示。b、c，d、e中进行的统计检验：单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。h中进行的统计检验：采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析*P<0.05**P<0.01，***P<0.001****P<0.0001；NS，不显著。在源数据文件中可找到精确的P值。图5a中的图像是使用BioRender.com创建的。

我们选择重点评估在许多植物性食品中发现的黄酮类天然化合物，这些化合物已被证明通过调节细胞衰老和氧化应激而具有抗衰老特性^15-17^，⁴⁸。首先，我们测试了HK中可检测到的六种最具代表性的黄酮类化合物（异槲皮素、山奈酚、川陈皮素、异鼠李素、木犀草素和木犀草素-7-O-葡糖醛酸化合物）、一种木脂素（松脂酚）和两种酚酸（3,4-二咖啡酰奎宁酸和迷迭香酸），评估了它们在1μM下影响衰老诱导的能力。在HK成分处理的IMR90成纤维细胞中，只有木犀草素（Lut）、木犀草素-7-O-葡糖醛酸化合物（LutG）和3,4-二咖啡酰奎宁酸（DQ）显著地将UV-B辐射诱导的SA-β-Gal染色减弱到与HK处理相似的水平（图5b）。值得注意的是，Lut是最常见的已鉴定黄酮苷元，与其衍生物一起占提取物的1.33%（w/w）（补充表4）。因此，我们决定进一步探索Lut及其衍生物的作用。

Lut治疗以剂量依赖的方式阻止SA-β-Gal阳性细胞的积累，其程度与HK治疗的紫外线照射IMR90成纤维细胞中的情况相似（图5c）。Lut在阿霉素诱导的衰老中也阻止了SA-β-Gal阳性细胞积累，其程度与HK治疗的WI38成纤维细胞和阿霉素处理的iCM中的作用相似（图5d，e和扩展数据图4a，b）。在100 mg ml-1白蛋白处理诱导衰老的HK-2肾近端肾小管细胞中，Lut和HK的衰老改善趋势并不显著（扩展数据图4c）。总的来说，这些数据支持我们的假设，即木犀草素通过改善各种外部压力诱导的不同细胞类型中SA-β-Gal的阳性率，说明它是HK植物复合物中的一种活性成分。

Lut的体内存在已通过药代动力学数据得到证实。小鼠经口灌胃0.5 mg kg^-1 HK，并在治疗后15、60和360分钟取血浆。在样品中检测到木犀草素，治疗后15分钟的Cmax约为55 ng ml^-1（图5f）。

在细胞衰老的急性体内模型中，C57BL/6小鼠在注射10 mg kg^-1阿霉素前3天用0.5 mg kg^-1的Lut进行预处理。7天后，处死动物，通过测量组织中SA-β-Gal阳性细胞的百分比来评估衰老情况（图5g）。Lut治疗显著保护了Doxo诱导的SA-β-Gal阳性细胞积累，表明在相对较低的剂量下，Lut对衰老特征具有改善作用（图5h）。

鉴于Lut抑制细胞衰老的能力，我们想描述这种作用背后的分子机制。因此，我们使用公开可用的数据集（ChEMBL；SIB；SEA Search Server）进行了对接分析。在预测与木犀草素在相似性基础上相互作用的蛋白质中，我们鉴定出了细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）。通过计算机分析，我们通过评估GLIDE Docking评分⁴⁹（一种近似配体结合自由能的经验评分函数）计算了木犀草素与CDK6之间的亲和力。该分析表明，木犀草素可以以强大的亲和力结合CDK6，尽管其预测亲和力与其他黄酮类化合物或HK成分（例如非瑟酮、芹菜素）相似（扩展数据图5a）。

CDK6调节细胞周期从G1期进展到S期。在细胞损伤条件下和衰老过程中，CDK6活性被p16的相互作用阻断（参考文献9）。鉴于HK提取物及其成分木犀草素可以延缓衰老的开始，我们假设它与CDK6的结合可能会阻碍CDK6和p16之间的相互作用，使激酶对p16依赖性抑制更难抵抗。首先，我们构建了一个涉及CDK6、p16和木犀草素的复合物的计算机三维模型。木犀草素被预测会结合这两种蛋白质的界面，这表明木犀草素与CDK6的存在可能会破坏与p16的相互作用（图6a）。然后，我们建立了一种表面等离子体共振（SPR）检测方法来研究CDK6-p16相互作用：将p16固定在芯片上，并以越来越高的浓度加入重组CDK6。该检测能够可视化CDK6-p16相互作用（图6b和扩展数据图5b、c）。相反，在木犀草素存在的情况下，相互作用被显著破坏。值得注意的是，另一种具有已证实的食疗特性和与木犀草素相似化学结构的黄酮类化合物非瑟酮¹³在相同浓度下无法破坏该相互作用。

图6.木犀草素对p16-CDK6复合物的破坏作用。a、通过对接计算结果的比对获得CDK6-p16复合物与木犀草素的原子模型。b、 SPR分析以确定CDK6-p16单独或与非瑟酮（Fis）或Lut的相互作用（对照组n=4，CDK6+Fis n=5，CDK6+Lut n=5独立实验）。c、 UV-B照射的WI38成纤维细胞中CDK6-p16相互作用的PLA的代表性图片，用Lut（0.1和1μM）预处理1小时。比例尺，合并面板中为100μM，DAPI和p16-CDK6-PLA面板中为25μM。实验独立进行了两次，结果相似。d、 PLA测定的定量分析（在两个独立实验中观察到的UT n=134，UV-B 6 h n=142，Lut 0.1 6 h n=122，Lut 1 6 h n=170个细胞）。e、 WI38细胞UV-B照射前后指示蛋白质的蛋白质印迹分析（n=2个独立实验）。b和d中的数据以平均值±标准误差表示。在b中进行了统计检验：单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。d中进行的统计检验：采用Bonferroni多重比较检验的单因素方差分析**P<0.01，****P<0.0001；NS，不显著。在源数据文件中可找到精确的P值。

为了验证p16-CDK6相互作用的破坏是否是木犀草素的作用机制，我们在WI38成纤维细胞中采用了原位邻近连接试验（PLA）。在UV-B照射前，用不同浓度的木犀草素（0.1μM和1μM）预处理细胞1小时。照射后6小时，细胞被固定，p16-CDK6相互作用通过PLA和共聚焦显微镜得到证实（图6c）。通过实验确定了每个成像细胞的平均荧光强度（MFI），从而能够量化该相互作用。UV-B照射细胞的MFI明显高于未经处理的未照射细胞或在UV-B暴露前用木犀草素预处理的细胞（图6d）。为了确认MFI的变化不是由于蛋白质表达的变化，我们在相同的条件下进行了蛋白质印迹分析。UV-B暴露上调了未经处理和木犀草素处理的细胞中p16的表达，但不影响CDK6蛋白的表达水平（图6e）。正如预期的那样，参与细胞周期的其他蛋白质也因UV-B暴露而下调，如Cyclin D1（CCND1）。综上所述，这些数据表明木犀草素可以在衰老诱导条件下改变p16和CDK6之间的相互作用，从而可能改变衰老表型的发展。

此外，我们通过分析CDK6激酶活性的直接下游靶点：高磷酸化Rb来证实这些发现。将IMR90成纤维细胞进行血清饥饿处理（使用0.2%胎牛血清（FBS）培养）48小时，导致静止和细胞周期同步⁵⁰。48小时后，加入含有10%FBS的细胞培养基，按分组加入或不加入1μg ml^-1 HK或0.1μM木犀草素（Lut 0.1），将细胞从细胞周期阻滞中释放出来。6小时后，收集细胞进行蛋白质印迹分析，以检测CDK6磷酸化残基上过度磷酸化的Rb（参考文献51,52）（扩展数据图5d，e）。与血清饥饿处理的细胞裂解物（时间0，t 0）相比，HK和Lut处理的细胞显示出比未处理的细胞更高的Rb磷酸化，表明这两种处理都以CDK6依赖的方式促进了细胞周期阻滞的逃逸。综上所述，这些结果表明木犀草素和含有木犀草素的植物提取物如HK可以影响CDK6-p16轴，从而改变衰老表型。

讨论

大多数发达国家不断扩大的衰老人口导致了社会和经济成本的上升，因此需要开发能够促进健康衰老的治疗方法⁵。一个有前景的研究途径是研究植物提取物的潜力，植物提取物富含植物成分，可以研究或开发成健康促进剂¹²。值得注意的是，在从细胞培养到无脊椎动物、啮齿动物和人类的各种研究模型中，靶向细胞衰老的天然衍生化合物已经证明了改善健康寿命和总寿命的能力¹⁷。因此，植物提取物为开发能够促进健康衰老并减轻衰老人群的社会和经济负担的治疗方法提供了一个有前景的研究领域^3,11,12。去除衰老细胞已被证明可以促进健康的组织微环境，因为衰老细胞的积累会导致SASP的释放，从而导致轻度炎症，加剧与年龄相关的退行性疾病⁴。

在本研究中，我们描述了一种显示出回春效应的天然提取物。用HK（一种标准化的SH提取物）治疗可以改善细胞和组织衰老。在体外，HK治疗可预防UV-B和阿霉素诱导的衰老表型，证实了SH提取物先前对细胞的抗衰老作用^24,26。我们进一步将这些发现扩展到小鼠，表明每天在饮用水中用相对低剂量的HK（0.5 mg kg⁻¹）治疗可以改善与年龄相关的症状，如毛发变形、驼背、衰老和DNA损伤标志物的组织积累、肌肉力量，并显著延长动物寿命。非常有趣的是，我们报告说，工作剂量低得令人印象深刻，即可以在体内发挥草抑制作用；许多研究天然产品的研究使用了更高剂量的治疗方法，使其作为医疗食品、营养保健品或人类药物的未来发展变得不切实际^53,54。此外，治疗开始于相对较晚的年龄（20个月），此时小鼠已经开始出现与年龄相关的恶化。因此，通过HK治疗促进健康寿命并不是终身治疗的先决条件，这也突显了它作为未来人类使用的产品在开发中的实用性。

借助小鼠腓肠肌基因表达的大体积RNA测序，我们发现了一种独特的衰老特征，其中包括与炎症、衰老和SASP相关的基因。重要的是，在老年小鼠中上调的标志性MICE_ADULT_UP被HK治疗显著下调。在衰老肌肉中上调的这一亚群基因在基因集SAUL_SEN_MAYO中明显过表达，该基因集最近被描述为衰老和衰老治疗的有力代表⁴⁰。尽管与未经治疗的转录组相比，SAUL_SEN_MAYO在HK治疗组中下调，但腓肠肌治疗对与已建立的衰老相关途径（如营养感应、蛋白质抑制、表观遗传调控或干细胞维持）相关的基因的其他改变没有显著影响。尽管需要进一步的研究来排除HK治疗改变与健康寿命延长相关的其他机制的可能性，但这一证据表明，HK治疗对年龄诱导的炎症、SASP和衰老的调节起着重要作用。

我们研究的优势之一是，我们研究了HK治疗在几种组织中对抗与年龄相关的衰老的作用，以及对抗不同形式的衰老诱导的作用。我们研究了TIS，因为有广泛报道称，健康组织内的衰老积累可能是化疗的脱靶效应⁴³。我们使用了Doxo进行实验，这是一种化疗药物，通过抑制拓扑异构酶II来增强DNA损伤和氧化应激，从而诱导衰老（参考文献47）。癌症患者的Doxo治疗会导致有害副作用，如与衰老和/或SASP释放相关的心脏毒性、纤维化、炎症、虚弱和疲劳⁴³^，⁴⁷。用低剂量HK预处理三天，然后单次注射阿霉素，显著降低了p16^LUC报告小鼠的p16表达。在另一项实验中，HK治疗通过缓解QT间期延长来改善阿霉素诱导的人类iCM衰老和心脏毒性，QT间期延长是患者致心律失常性心肌病的潜在病理机制⁴⁶。然而，进一步的研究应检查HK在预防慢性接触阿霉素引起的化疗引起的衰老中的作用，以更好地反映临床使用情况。木犀草素是HK的主要成分，已被证明可以在体外和体内减轻阿霉素诱导的心脏毒性和氧化应激^55,56。此外，我们能够用木犀草素治疗的阿霉素诱导的衰老iCMs也证实这一点。

先前的研究表明，HK具有抗氧化作用，并促进SIRT1的RNA表达（参考文献26）。在本研究中，我们更详细地探讨了HK发挥抗衰老活性的机制。HK植物复合物已被证明含有多种成分，包括多酚和萜类化合物。其中，我们选择进一步评估六种黄酮类化合物、两种酚酸和一种木脂素在UV-B处理的IMR90人肺成纤维细胞中的抗衰老特性。在受试化合物中，木犀草素、木犀草素-7-O-葡糖醛酸化合物和3,4-二咖啡酰奎宁酸处理在防止衰老积累方面显示出唯一显著的功效，如SA-β-Gal测定所示。由此，我们对木犀草素进行了进一步的研究。木犀草素在成纤维细胞和iCM中显示出与HK相似的抗衰老特性。值得注意的是，我们在体外测试的木犀草素的量在我们评估的HK浓度可以确定的相对浓度范围内，证明了该数据集的相关性。UPLC-QTOF-MS化学分析显示，木犀草素或其糖苷衍生物以葡糖苷酸、二葡糖苷和芸香苷的形式占HK提取物中总黄酮的约40%。考虑到之前的文献表明，已知木犀草素的糖苷/葡糖苷酸衍生物在体内^27,57水解为苷元形式，木犀草素在HK作用机制中的作用可能是相当重要的。

木犀草素不是SH独有的，是许多可食用蔬菜和草药中常见的膳食化合物。木犀草素具有多种已知的生物学特性，具有抗氧化、抗炎和抗癌特性^27,57,58，并已被证明可以通过调节去乙酰化酶、AMPK/mTOR通路和NF-κB^21,22,48来改善不同细胞类型中应激或治疗诱导的衰老模型中的衰老或SASP。与具有药理学多样性的天然产物一样，很难将单一的表型效应（例如衰老诱导）归因于单一的通路。从广义上讲，据报道，富含黄酮类化合物和多酚的植物性食物或提取物通过衰老调节以外的几种作用机制具有广泛的长寿促进作用，包括调节肠道微生物组以保持NAD+水平^59,60。诚然，我们目前的工作广泛关注衰老调节，其中HK和木犀草素也可能促进其他延长生命和健康的机制，这与之前的体外研究一致，表明SH可以减弱过量ROS并上调SIRT1 mRNA^24,26。尽管如此，鉴于木犀草素的大量细胞活性报道^27,57,58，我们提出了一种新的机制，通过这种机制，木犀草素可以特异性地改变衰老表型。

通过计算分子对接，我们预测木犀草素能以良好的亲和力结合细胞周期调节因子CDK6。此外，木犀草素经模拟显示可破坏细胞周期抑制剂p16与CDK6的结合，我们通过SPR证实了这一点。在这里，木犀草素显著降低了p16结合CDK6的能力。我们还测试了非瑟酮的作用，这是一种具有相似化学特性和显著抗衰老作用的黄酮类化合物¹³。有趣的是，尽管我们和其他人⁶¹证明了非瑟酮与CDK6具有良好的亲和力，但非瑟酮并没有影响SPR测定的p16-CDK6相互作用。一种可能性是，非瑟酮可以在更高浓度下破坏SPR分析的p16-CDK6复合物；然而，由于系统中高浓度黄酮的溶解度，我们无法测试这一点。此外，我们假设，虽然木犀草素和非瑟酮都与CDK6中的同一位点结合，但木犀草素有两个面向p16结合界面的-OH部分，而非瑟酮有一个面向内部位置的-OH基团。理论上，这可以解释它们破坏p16-CDK6相互作用的不同能力，尽管它们对CDK6有共同的亲和力。然而，需要额外的生化分析来最好地理解这种作用机制。

为了证实我们的发现，我们利用原位PLA来评估p16和CDK6之间的相互作用。PLA是一种检测蛋白质相互作用的免疫测定法，分辨率为40 nm。暴露于UV-B辐射的WI38成纤维细胞显示出显著增强的PLA信号，这与紫外线暴露导致的p16蛋白表达增强一致。然而，在木犀草素预处理的细胞中，该信号显著减弱，而UV-B暴露细胞中p16或CDK6的蛋白表达没有变化。因此，观察到的木犀草素引起的PLA信号变化可能是由于p16-CDK6相互作用的破坏造成的，从而证实了我们的计算和SPR数据。

事实上，我们通过研究CDK6信号传导的直接下游靶点Rb的磷酸化，进一步评估了木犀草素破坏p16-CDK6复合物的可能性。在血清饥饿处理48小时后，通过加入含有或不含有HK或木犀草素的血清培养基，使细胞从细胞周期阻滞中释放出来。6小时后，大约在细胞周期G1期的中途，HK或木犀草素显著增加了已知被CDK6磷酸化的残基处的Rb磷酸化（参考文献51,52）。

由于p16表达的增加既是细胞衰老的标志，也是通过细胞周期抑制衰老发展的机制，因此p16-CDK6相互作用的破坏和随后Rb的磷酸化可能代表了天然产物可以预防或延缓衰老的机制。应进行进一步的研究以证实抑制p16-CDK6相互作用在衰老中的重要性。先前的研究表明，敲除p16可以防止正常人二倍体成纤维细胞的复制性衰老⁶²。同样，转基因INK-ATTAC小鼠可以诱导p16阳性衰老细胞的消除，表现出与年龄相关的组织功能障碍和寿命延长的改善，从而表明靶向p16-CDK6轴可以提高与年龄相关疾病和生活质量⁶³。事实上，在INK-ATTAC小鼠中选择性消除p16阳性细胞会导致骨骼肌功能改善，衰老个体的肌纤维直径增大，这反映了我们自己的发现，与未治疗的小鼠相比，经HK治疗的老年小鼠握力保持不变，肌纤维增厚，衰老标志物减少。最终，用天然产物治疗可能抑制p16的概念是开发人类使用物质的一种有吸引力的替代方法。鉴于p16作为细胞周期抑制剂的作用，一个潜在的问题可能是它的抑制可能会导致潜在的致癌作用。然而，木犀草素的摄入与癌症无关；相反，它已经证明了抗癌作用，在我们的研究中，与年龄匹配的未经治疗的对照组相比，接受HK治疗的小鼠中没有小鼠显示出更高的肿瘤发生率⁵⁷。这一观察结果还可能与预防衰老积累有关，因为衰老的未转化成纤维细胞以SASP依赖的方式促进上皮细胞的恶性转化⁶⁴。

这项研究可能有一些局限性。首先，尽管我们的工作评估了与衰老相关的各种参数，并确定了细胞衰老的调节是HK支持寿命的一种机制，但重要的是要注意，组织衰老在分子和细胞上是异质的，其他衰老标志也可能受到体内HK治疗的调节。我们之前已经确定了HK在调节氧化应激中的作用，以及体外SIRT1 mRNA ^24,26，这应该在进一步的HK动物研究中进行研究。

其次，虽然木犀草素从HK中被鉴定为具有抗衰老特性的成分，但HK是一种化学复杂的植物制剂。事实上，研究复杂的植物提取物所固有的是，在识别活性成分方面存在数百个混淆变量。尽管我们应用了体外技术从HK衍生成分中鉴定木犀草素作为具有抗衰老活性的感兴趣分子，但我们并没有详尽地评估这些分子协同组合的潜力，因为它们存在于植物提取物中。此外，尽管我们已经将HK的治疗与总寿命和健康寿命的延长联系起来，但在缺乏单一纯化药物的体内研究的情况下，认为一种成分（例如木犀草素）是导致这种效果的原因只是推测。因此，进一步的研究应该调查木犀草素和木犀草素衍生物在延长总寿命和健康寿命方面的作用。

第三，我们的工作利用了一种近交系小鼠C57BL/6。尽管这是一种常见的做法，但使用基因异质的小鼠可以产生更确切的结果，最大限度地减少菌株特异性倾向作为研究人工因素的影响^65-67。

综上所述，我们的研究表明，HK是一种富含黄酮类化合物的SH标准化天然植物提取物，可以显著改善与衰老表型调节相关的年龄相关组织功能障碍。我们发现HK含有木犀草素，木犀草素可能与HK的一些抗衰老作用有关，这些作用与p16-CDK6相互作用的破坏有关。我们的研究表明，HK治疗在相对较低的剂量下具有显著的抑制衰老和延长寿命的作用，并且显示出良好的安全性。这些数据为HK未来作为治疗年龄相关疾病的医疗食品或药物的研发提供了良好的平台。

文章链接：

https://doi.org/10.1038/s43587-024-00663-7

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ashwoodnurseries.com

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