J Invest Dermatol | 优化皮肤表面代谢组学：采样方法、提取剂和分析技术的综合评估

科技 2024-10-24 09:57 上海

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编辑｜木朵

文章导读

皮肤表面代谢物指纹图谱能够表征皮肤表面小分子的分布特征，为皮肤生物学以及微生物 - 宿主互作研究提供有价值的线索。要保证数据准确并且可重现，制定皮肤表面代谢组学的标准操作规程（SOP）显得尤为重要。然而，目前该领域的系统性研究还相对匮乏。本项研究针对皮肤表面代谢组学样本处理的诸多因素展开了评估，涵盖采样材料、提取溶剂、胶带粘贴方法（具体包含粘贴次数和胶带数量）以及分析技术等。研究结果表明，D-Squame® D100 胶带与 methyl tert-butyl ether/methanol 提取剂的组合是开展皮肤表面脂质组研究的最优选择。一般情况下，使用单胶带五次反复粘贴即可获取足够生物量样本用于脂质组学研究；然而对于水溶性物质，其最佳粘贴操作则有所不同。本研究比较了相对定量和半定量脂质组(Relative and semi-quantitative pseudotargeted lipidomics)、相对定量和绝对定量代谢组(Pseudotargeted metabolomics and targeted metabolomics)以及绝对定量氧化脂质组(Quantitative oxidized lipidomics)五种常用代谢物分析检测技术，展示了在不同分析中物质检测定量级别、物质类别和具体物质的共有性及独特性。此外，本项研究还发现皮肤表面代谢物之间存在关联，其中部分关联代谢簇可能是微生物皮肤型(cutotypes)的形成基础。本研究为微生物-宿主互作探究提供了工具与思路。

文章信息

原文标题：Optimizing Skin Surface Metabolomics: A Comprehensive Evaluation of Sampling Methods, Extraction Solvents, and Analytical Techniques

期刊：Journal of Investigative Dermatology

发表时间：2024年9月

第一作者：复旦大学人类表型组研究院-陈慧真、迈维代谢-陈宇、安徽医科大学-周怡

通讯作者：粤港澳大湾区精准医学研究院-夏晶晶、复旦大学生科院-王久存

其它作者：曹深松、路静、韩涟漪、Thomas Worzfeld、Jean Krutmann

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jid.2024.08.027

正文解读

皮肤是一个复杂的生态系统，定植着大量的细菌、古菌、真菌和病毒。皮肤表面的小分子代谢物集合——代谢组（包含所有低分子量化合物），是这个生态系统的重要组成部分。这些物质不仅可作为营养塑造微生物的群落结构，亦可进一步代谢为生物活性物质作用于皮肤，影响皮肤状况。因此，研究皮肤表面代谢组不仅可以帮助我们理解宿主-微生物相互作用的机制，对寻找皮肤或系统性疾病的皮肤表面标志物亦具有重要意义。

代谢组学对样本中的所有化合物进行无偏性分析，其数据质量很大程度上取决于样本采集和制备的质量。对于大规模人群研究，采样的便利性和可靠性都至关重要。目前用于收集代谢物的各种方法在有效性方面存在差异。胶带剥离、cupping和擦拭由于非侵入性而常被使用。特别是胶带剥离具有若干优势，包括皮肤刺激风险低（因为不使用有机溶剂）、稳健性以及影响结果的变量（例如压力、方向）较少。胶带的特性，如黏附能力、黏附层均匀的组成和分布以及高柔韧性，有助于从具有沟回弹性网络和三维结构特征的皮肤表面无偏性地采集生物样本。这使得化学探测器能够准确地识别和量化样本。然而，胶带剥离过程的诸多变量，例如胶带黏合剂（例如丙烯酸、硅胶或聚氨酯胶）的选择、提取溶剂以及粘贴方法（包括粘贴次数和胶带数量），会对代谢组学的数据质量以及后续的生物学解释产生影响。此外，分析技术的选择也会影响结果。目前，在基于色谱-质谱的代谢组学分析中，通常采用三种策略：靶向、非靶向和拟靶向。拟靶向方法具有代谢物覆盖度高和重现性出色的优势，在分析化合物多样性高的皮肤表面代谢物时表现尤为突出。然而，这些领域的系统研究有限，这凸显了建立皮肤胶带剥离标准操作规程（SOP）用于皮肤表面代谢组分析的迫切需求。

在本研究中，我们（i）比较了三种胶带类型和三种提取溶剂的性能，以确定用于样本采集和制备的最佳组合；（ii）建立了一种胶带剥离方法（粘贴次数和胶带数量）以收集达到检测阈值的足够生物量；（iii）对健康人类受试者前臂的脂质和水溶性化合物进行了表征（图 1）。

图1 图文摘要

为保障高质量的比较及后续研究中生物量低的挑战，该研究选择手臂的掌侧（毛孔分布均匀、生物量低）作为研究对象。首先，我们探究了不同类型胶带对采样的影响。在此，我们评估了皮肤代谢组研究中常用的三种具有不同黏合剂类型的胶带：D-Squame® D100 [DS]、医用聚乙烯 [PE] 和医用无纺布 [NWM] 胶带（图2a）。样本采用甲基叔丁基醚 / 甲醇（MTBE: MeOH 3:1，v/v）进行提取。

这三种胶带都能成功检测到化合物（有 396 种化合物重叠），但每种胶带都呈现出特定的脂质偏好（图 2b 和图 2c）。DS 胶带的检出效果最佳，能够采集到最多数量的脂质。PE 胶带和 NWM 胶带分别位列第二和第三（图 2b 和图 2c）。此外，仅在 DS 胶带检测到的脂质有 71 种（占使用 DS 胶带采集到的总脂质数量的 8.1%），而使用 PE 胶带和 NWM 胶带时，这一比例分别为 2.9% 和 1.9%（图 2d）。此外，结果表明，通过 DS 胶带检测到的皮肤表面主要脂质类别包括 FFAs、甘油三酯（TGs）、甘油二酯（DGs）、神经酰胺（CER）和胆固醇酯（CE），它们总共占总脂质的 90% 以上（图 2e）。

图2 不同胶带对物质检出数量的影响

使用每种胶带在同一皮肤部位连续剥离五次，然后用三种提取剂进行样本提取（图 3a）。由于提取剂相分离特性差异（图 3b），后续处理过程的复杂程度有所不同。更重要的是，由于极性不同，提取剂提取脂溶性化合物的能力也有所差异。为了进一步探究这一方面，我们在皮肤脂质组研究中使用了三种典型的提取剂：甲基叔丁基醚/甲醇（MTBE: MeOH 3:1，v/v）、三氯甲烷/甲醇（TCM: MeOH 2:1，v/v）和异丙醇，以下分别简称为 MTBE、TCM 和 IP。

对于DS 胶带或 PE 胶带，都在与MTBE提取剂联合使用时，在物质总检出数量上表现最佳（图 3c 和图 3d）。其中，DS胶带和MTBE提取剂组合的物质总检出数最多（图3c）。对于NWM 胶带，使用IP 提取剂提取的化合物数量最多，但与其他胶带-提取剂组合相比，其物质总检出数明显较低（图 3e）。综上，DS 胶带和 MTBE提取剂是皮肤表面脂质鉴定的最佳前处理组合。

图3 不同提取剂对物质检出数量的影响

为建立皮肤表面代谢组研究中的胶带剥离标准操作规程（SOP），我们进一步评估了胶带剥离方法，尤其关注粘贴次数以及所用胶带数量所覆盖的总面积。我们比较了多种粘贴次数，包括3 次、5 次、8 次和 10 次。结果显示，鉴定出的化合物总数在 500 左右，并不会随着粘贴次数而显著增加（图 4a）。值得注意的是，在第 5 次剥离之后，胶带几乎不具有黏附力。因此，接下来的操作流程标准化为每种胶带粘贴 5 次。

此外，我们研究了使用不同数量的胶带对脂溶性和水溶性化合物检测的影响。研究结果表明，无论使用相对定量或半定量拟靶向脂质组学方法，胶带数量的增加并不会增加检测到的脂质数量（图 4b 和图 4c）。两种方法鉴定出的化合物数量相对稳定，分别约为 500 和 400。这表明单条胶带粘贴 5 次足以进行脂质检测。对于水溶性物质，胶带数量的增加会显著增加物质的检出数量（图 4d）。值得注意的是，在 150 种可检测的水溶性化合物中，有 23 种化合物在使用多于1条胶带时检测概率增加。此外，有 23 种化合物只有在使用两条以上胶带时才可检测（图 4e）。胶带数量的增加会使代谢物（包括脂溶性和水溶性化合物）的检出相对丰度提高（图 4f）。

图4 不同粘贴策略对物质检出的影响

除脂质外，皮肤表面的水溶性物质亦在维持皮肤健康方面起着重要作用，然而该类物质尚缺乏系统性研究。为了更全面地了解皮肤表面的水溶性成分，我们采用 1 条胶带、2 条胶带和 3 条胶带采集样本（图 4e）。这些样本后续采用了两种方法检测：拟靶向代谢组学和靶向代谢组学。

拟靶向代谢组共检测到695种化合物，覆盖 17 个亚类，包括 353 种氨基酸及其衍生物、61 种有机酸及其衍生物、50 种核苷酸及其衍生物、47 种杂环化合物、39 种醇类和胺类以及 145 种其他化合物（图 5c）。尽管拟靶向代谢组的物质总检出数较高，但缺乏可靠的定量分析。因此，我们还采用了靶向代谢组。该方法共检测到150种化合物，覆盖25个类别，包括30种氨基酸及其衍生物、17 种有机酸及其衍生物、15 种胆汁酸、14种小肽、12种核苷酸及其衍生物以及62种其他化合物（图 5b）。值得注意的是，有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和甲亚胺酸是核心类别，占皮肤水溶性化合物总量的 90% 以上（图 5a）。六种含量最丰富的化合物是尿刊酸（UCA）、乙酰胺、L - 焦谷氨酸、组氨酸、尿素和丝氨酸，约占水溶性化合物总量的 85%（图 5d）。

此外，数据揭示了代谢物之间有趣的关联。尿刊酸（UCA）的相对丰度与某些有机酸（癸二酸和辛二酸）和游离脂肪酸（十六碳二酸、十八碳二酸）呈负相关（图 5e）。十八碳二酸和十六碳二酸是在皮肤代谢组学中研究较少的两种游离脂肪酸，与其他化合物表现出一致的关联性。它们都与尿刊酸以及各种氨基酸及其衍生物（酪氨酸、蛋氨酸亚砜、L -异亮氨酸、L -谷氨酸、苯丙氨酸和精氨酸）呈负相关（图 5e）。此外，2 -羟基十六烷酸（一种游离脂肪酸）也与若干氨基酸及其衍生物呈负相关，包括甘氨酸、蛋氨酸亚砜、L -谷氨酸、L -正缬氨酸、L -异亮氨酸、L -亮氨酸和苯丙氨酸（图5e）。L -异亮氨酸能调节皮肤中的I型和III型原胶原合成，也是皮肌炎的潜在生物标志物，它与其他氨基酸（如L -亮氨酸、L -正亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸）呈正相关（图 5e）。

图5 健康人皮肤表面水溶性物质的概况和特征

本研究对五种不同的分析技术进行了比较。相对定量的拟靶向方法显示出更优的物质检出能力，然而其缺乏准确的绝对定量（图6a）。拟靶向方法（半定量）和靶向方法（绝对定量）的物质检出数分别位列第二和第三（图6a）。值得注意的是，这些方法之间有 435 种物质和 40 个类别是共有的（图 6a 和图 6b、补充表 S1和 S2）。在拟靶向脂质组学的相对定量和半定量之间，以及拟靶向代谢组学（相对定量）和靶向代谢组学之间，化合物存在较高的重叠。

图6 五种分析技术检出物质的共同性和特异性

本项研究为皮肤表面代谢组学研究建立了一个较全面、可靠的SOP，期望有助于皮肤生物学、微生物-宿主互作研究，并助力临床探索疾病的皮肤表面生物标志物。

文章链接：

https://doi.org/10.1016/j.jid.2024.08.027

封面来源：

researchgate.net

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