类视黄醇激活刺激受体TRPV1并产生感觉超敏反应

科技 2024-08-06 23:51 湖南

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翻译｜旎旎

编辑｜木朵

摘要

类视黄醇是维生素A的结构相关的衍生物，是正常视力以及细胞增殖和分化所必需的。在临床上，类视黄醇对治疗许多皮肤病和癌症都是有效的。类视黄醇的应用会引起大量的刺激性副作用，包括疼痛和炎症；然而，导致感觉超敏反应的确切机制尚不清楚。在这里，我们表明，天然发生和合成的类视黄醇激活重组或天然瞬时受体电位通道香草酸亚型1（TRPV1），它是辣椒辛辣成分辣椒素的刺激性受体。在体内，类视黄醇产生了与疼痛相关的行为，这些行为通过对TRPV1功能的基因或药物抑制而被消除或显著减少。这些发现确定了TRPV1是类视黄醇的离子性受体，并为类视黄醇诱发的超敏反应提供了细胞和分子方面的见解。这些发现也表明，选择性TRPV1拮抗剂是治疗类视黄醇诱导的感觉超敏反应的潜在治疗药物。

引言

类视黄醇是 4000 多种已知天然和合成维甲酸分子的总称，在结构上和/或功能上与维生素 A 有关。非常活跃的生物和发挥各种深远的影响在视觉、细胞增殖、分化、凋亡、炎症、器官发生、生殖和发展（1、2）。由于公众对天然和合成类视黄醇的兴趣和需求相当大，因为它们已被证明对许多治疗适应症都有好处，包括但不限于癌症、皮肤病和糖尿病(2)。例如，使用全反式维甲酸（ATRA，维A酸）通过诱导微摩尔浓度的白血病细胞的分化和凋亡(2)，治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）非常成功。许多皮肤疾病，包括痤疮和牛皮癣，也可以成功地用局部类视黄醇治疗(3)。事实上，维A酸是第一个获食品和药物管理局批准（FDA批准）的局部类视黄醇，可用于治疗寻常痤疮（美国最常见的皮肤疾病）(4)。视黄醇（维生素A）已被用于化妆品配方，以减少皱纹和改善脂肪团，并于1996年被FDA批准用于抗衰老治疗(3)。

类视黄醇的多效性效应是由两个已知的核受体家族介导的，这两个家族都属于类固醇-甲状腺激素受体超家族：维甲酸受体（RARs）（α、β和γ同型）和类视黄醇x受体（RXRs）（α、β和γ同型）。RARs和RXRs通过以异二聚体的形式与靶基因中的调控区域结合，作为配体依赖的转录调控因子（2,3）。内源性配体ATRA选择性地与RARs结合，而9-顺式维甲酸（9-顺式-RA，阿利维A酸）对RARs和RXRs都具有高亲和力(2)。

尽管有许多有益的作用，类视黄醇有大量的刺激性副作用。局部应用类视黄醇常引起严重的局部刺激，表现为烧灼感、瘙痒、红斑、脱皮或干燥(5)，通常被称为“类视黄醇皮炎”。当系统使用时，类视黄醇也会引起严重的头痛、肌肉疼痛、关节疼痛、骨痛和炎症性背痛（6-8）。类视黄醇引起的刺激已成为一个主要的临床问题，也是许多患者停止类视黄醇治疗的主要原因（9-13）。动物研究表明，口服或鞘内应用ATRA可诱导伤害性感受行为效应，这表明类视黄醇对伤害性感受通路的敏感性（14,15）。然而，介导类视黄醇诱导的感觉超敏反应的分子机制尚不确定，这些副作用缺乏高度的有效治疗选择。对类视黄醇引起的感觉过敏反应的细胞和分子机制的了解可能会导致临床有用的治疗方法的发展

皮肤炎症是对有害的化学感觉刺激物的直接反应（16,17），包括类视黄醇。表皮角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞在应对有害刺激时释放细胞因子，除了其他炎症作用外，还能使外周伤害性纤维敏感，并产生神经源性炎症和疼痛（18）。另外，类视黄醇可以直接增加痛觉感受器的兴奋性，并产生神经源性炎症（18）。

有趣的是，类视黄醇皮炎和神经源性炎症的症状非常相似（19），这增加了类视黄醇诱发神经源性炎症以诱发皮肤刺激的可能性。初级感觉神经末梢，特别是无髓鞘的c纤维，介导周围的神经源性炎症，并将疼痛传递到中枢神经系统（16）。躯体感觉神经元表达的瞬时受体电位（TRP）通道是热、化学和其他感官刺激的关键分子传感器（20）。越来越多的证据表明，一些温度敏感的TRP通道（thermoTRPs）参与了炎症性疼痛和痛觉（21）。在这里，我们发现自然发生的和合成的类视黄醇都是特定的瞬时受体电位通道香草酸亚型1（TRPV1）激活剂，刺激伤害性感觉神经元并唤起感觉超敏反应，这被基因消融或TRPV1功能的药物抑制所抑制。此外，辣椒素激活所需的“香草素结合袋”的破坏也会消除类视黄醇对TRPV1的激活。我们的研究结果表明，TRPV1是一种离子型类视黄醇受体，在组织损伤和一些皮肤治疗的情况下，它介导类视黄醇诱导的感觉超敏反应。

结果

自然产生的和合成的类视黄醇都能激活重组TRPV1

生物活性脂质在TRP通道信号转导中发挥重要作用（22,23）。为了鉴定新的thermoTRPs的脂质调节因子，我们筛选了一个包含195种生物活性脂质的生物活性脂质库（Enzo Bioscience）。筛查靶点包括TRPV1、TRPV3、TRPA1和TRPM8。细胞内钙离子（[Ca2+]i）的增加被用作HEK293T细胞中异质表达的TRP通道活性的功能读数（荧光成像平板阅读器[FLIPR]；分子装置）（24）。在确认了已知的TRP通道激活剂的兴奋作用，包括大麻素和溶血磷脂酸（LPA）的兴奋作用后，我们还观察到了在表达 TRPV1 的 HEK293T 细胞中应用 4-hydroxyphenylretinamide (4-HPR) 或 AM580 这两种维甲酸类似物时产生的强健且可重复的信号。相比之下，在表达TRPA1、TRPV3或TRPM8的细胞中没有诱发活性（图1A和补充图1；本文在线获得的补充材料；doi：10.1172/JCI66413DS1）。TRPA1、TRPV3和TRPM8的功能通过它们对各自通道的选择性激动剂的反应性得到证实（补充图1）。

图1.通过类视黄醇合成和天然类视黄醇激活重组TRPV1的情况。(A) AM580（100 μM）和4-HPR（100 μM）在转染了重组TRPV1的HEK293T细胞中特异性诱发[Ca2+]i反应。两种类视黄醇对转染了TRPA1、TRPV3或TRPM8的HEK293T细胞均无影响。y轴表示在减去单独对载体的基线反应后，由AM580和4-HPR诱导的相对荧光单位（RFU）的净增加。(B)左：具有代表性的痕迹显示AM580激活TRPV1介导的电流以浓度依赖的方式。右：从左边的轨迹中可以看，在指定时间点拍摄的代表性电流-电压（I-V）曲线表明，AM580在1 μM (b)时诱发了向外整流的全细胞电流，而10 μM (c) AM580在表达TRPV1的HEK293T细胞中激活了具有线性I-V关系的电流（a指基线响应）。(C)一种内源性类视黄醇，9-cis-RA，也以浓度依赖的方式激活TRPV1电流，类似于AM580激活的电流（a为基线反应；b和c分别表示10和30 μM 9-cis-RA激活的反应）。(D)AM580（10μM，n=5）和9-顺式RA（10μM，n=4）均增加了表达trpv1的HEK293T细胞的由内而外的单通道开放概率（nPo）（*P<0.05）。(E)合成的类视黄醇以浓度依赖性的方式激活TRPV1。(F)选定的内源性类视黄醇对表达trpv1的细胞的影响综述。在膜电位为-60mV时记录电流。对所有不同浓度的类视黄醇，n= 5-10。

值得注意的是，AM580和4-HPR（芬维A胺）都是核类视黄醇受体的有效激动剂，并可抑制多种癌细胞的增殖（3,27）。为了确定其他临床使用的合成类视黄醇是否也激活TRPV1，我们测试了阿维A、他扎罗汀和贝沙罗汀，这些都是第二代或第三代合成类视黄醇，已用于治疗癌症和皮肤疾病(3)。由于这些化合物与ATRA具有结构相似性（补充图2），我们很想知道自然产生的类视黄醇是否也能激活TRPV1。因此，我们使用全细胞膜片钳记录检测了β-胡萝卜素（维生素原A）、视黄醛、视黄醇、ATRA、9-cis-RA、13-cis-RA和棕榈酸视黄醇酯的影响。

在表达trpv1的HEK293T细胞中，除β-胡萝卜素和棕榈酸视黄醇酯激活膜电流外，所有类视黄醇均以浓度依赖的方式进行检测（图1，E和F，数据未显示）。AM580、9-cis-RA和ATRA的电压斜升（-100到+100 mV）的电流痕迹是在低浓度下向外整流，在高浓度下呈线性，类似于辣椒素和其他TRPV1激动剂激活的电流(参考文献28，图1、B和C，数据未显示)。有趣的是，在2 mM Ca2+存在的情况下，重复应用AM580和其他类视黄醇产生了TRPV1电流的显著脱敏和快速耐受性，这是TRPV1的典型特性(参考文献。29，补充图3，数据未显示)。此外，AM580和9-顺式-RA均增加了转染TRPV1的HEK293T细胞中由内而外的单通道活性，但对照组没有（图1D和数据未显示），表明类视黄醇激活重组TRPV1而不需要细胞内信号分子。然而，不同的类视黄醇的效力和疗效有所不同（图1，E和F，以及补充表1）。在最大可溶性剂量下，类视黄醇的疗效等级显示，AM580和9-顺式-ra分别是最有效的合成和自然产生的类视黄醇（图1，E和F）。这些结果强烈表明，自然发生的和合成的类视黄醇都是重组TRPV1的激活剂和/或调节剂。

类视黄醇通过TRPV1激活初级痛觉感受器

我们接下来询问AM580、9-顺式-ra和ATRA是否可以激活分离的小鼠背根神经节（DRG）神经元中表达的天然TRPV1。选择这3种类视黄醇的基本原理如下： (a)代表天然和合成类视黄醇；(b)9-顺式-ra和ATRA是类视黄醇核受体的关键天然配体，临床用于治疗皮肤病和癌症；(c)所有3种类视黄醇激活重组TRPV1（图1和补充表1）。使用AM580（5 μM）、9-顺式ra（30μM）和ATRA（300 μM）对离解的小直径野生型DRG神经元产生向外整流电流，这些神经元也对辣椒素和异硫氰酸酯（AITC）有反应，AITC是一种选择性TRPA1激动剂（图2、A和B，数据未显示）。与TRPV1介导辣椒素敏感痛觉感受器的维甲酸激活一致，选择性TRPV1拮抗剂AMG9810（0.1 μM）的共同应用几乎完全消除了am580激活的电流（图2，A-C）。

图2.在DRG神经元中，TRPV1功能的药物抑制或基因消融作用消除了am580诱发的膜电流、膜去极化和动作电位放电。(A)代表性电流痕迹显示，在野生型DRG神经元中，AM580（30 μM）激活了为+60mV的向外电流和-60mV的向内电流。AM580引起的全细胞电流被选择性TRPV1拮抗剂AMG9810 (0.1 μM)显著抑制。AMG9810在洗脱期后的抑制作用为部分可逆性。(B)在A中规定的时间点所取的Am580激活电流的电流-电压关系。(C)-60mV的DRG神经元对AM580的电流响应。AMG9810（0.1 μM）显著抑制了AM580的反应（*P < 0.05，n = 6）。(D)具有代表性的电压痕迹表明，AM580诱发了辣椒素敏感的膜去极化，并增加了野生型DRG神经元的放电率。(E) AM580在野生型小鼠的电沉默DRG神经元中产生膜去极化和动作电位，该神经元对AITC和辣椒素都敏感。(F) AITC而不是AM580或辣椒素诱导了Trpv1-/-小鼠DRG神经元的膜去极化。药物浓度：AM580,30 μM；辣椒素，1 μM；和AITC，100 μM。MP，膜电位。

AM580还诱发了膜去极化，并增加了电沉默神经元和表现出自发活动的神经元的动作电位的数量，这再现了同一野生型DRG神经元中辣椒素诱导的反应（每组n=5）（图2，D和E）。AM580和辣椒素在Trpv1-/-小鼠的DRG神经元中均未引起兴奋性膜反应（n = 16）。与之形成鲜明对比的是，TRPA1激活因子AITC在从Trpv1-/-和Trpv1+/+小鼠中分离出来的DRG神经元中诱导了类似的反应（图2F）。

接下来，我们使用钙成像来询问类视黄醇是否也能在DRG神经元中引起trpv1依赖的Ca2+内流。AM580、9-cis-RA或ATRA的浴液应用，在辣椒素敏感的野生型DRG神经元亚群中产生了强劲的[Ca2+]i增加（图3）。在表达trpv1的HEK293T细胞中，5 μM AM580是在约20%的DRG神经元中诱导[Ca2+]i反应的最有效激活剂(图(图3,3,a -c)，而30 μM 9-cis-RA和100 μM ATRA分别在约7%-10%的DRG神经元中诱发[Ca2+]i增加(图(图3,3,D-I)。我们观察到，与类视黄醇相比，辣椒素的应用引起了更多的神经元产生反应，这表明并不是所有TRPV1表达的神经元都对类视黄醇产生反应(图(图3,3,C, F, and I)。类视黄醇和辣椒素诱发的[Ca2+] I反应都被TRPV1功能的基因敲除完全消除，而AITC在TRPV1 +/+和TRPV1- / - DRG神经元中诱发了类似的[Ca2+] I反应(图(图3).3)。这些结果表明，类视黄醇模拟辣椒素诱导的TRPV1通道反应，并表明TRPV1是类视黄醇诱导的初级感觉神经元急性兴奋反应的唯一靶点。

图3.TRPV1是感觉痛觉感受器中类视黄醇的唯一靶点。AM580（A-C）、9-cis-RA（D-F）、ATRA（G-I）和辣椒素在来自Trpv1+/+的DRG神经元亚群中诱发了[Ca2+]i反应，而不是Trpv1-/-小鼠。（A，D和G）培养的DRG神经元的代表性Fura-2比率图像显示，AM580 (A)、9-顺式-RA(D)和ATRA (G)在来自Trpv1+/+的DRG神经元亚群中诱发了[Ca2+]i反应，而不是Trpv1-/-小鼠。神经元的颜色从蓝色转换为绿色或红色表示[Ca2+]i的增加。（B、E和H）有代表性的痕迹表明，AM580 (B)、9-顺式-RA(E)、ATRA (H)或辣椒素在Trpv1+/+中引起了[Ca2+]i反应，而不是Trpv1-/-DRG神经元。AITC在Trpv1+/+和Trpv1-/-DRG神经元中诱发了类似的[Ca2+]i反应。每个痕迹对应于单个神经元中荧光比值的变化。神经元暴露于每个类视黄醇（5 μM AM580,30 μM 9-cis-RA，或300 μM ATRA）、0.3 μM辣椒素、100 μM AITC和100 mM氯化钾指定时间。（C、F和I）从Trpv1+/+或Trpv1-/-小鼠中分离的DRG神经元对AM580 (C)、9-顺式RA(F)、ATRA (I)、辣椒素、AITC和氯化钾的反应百分比（对AM580每个基因型，n ≥330；对9-顺式RA和ATRA，每个基因型基因型n 为350）。

类视黄醇刺激神经肽释放并产生足部肿胀

神经源性炎症是炎症状态疼痛和肿胀的重要因素，疼痛和肿胀的特征（30,31）。痛觉感受器上的TRPV1的激活是神经源性炎症的主要因素（32,33）。TRPV1阳性痛觉感受器的激活从包括食道和结肠在内的许多周围神经末梢释放感觉神经肽（CGRP），在这些组织中，TRPV1只存在于外部感觉纤维中（34-39）。因此，我们假设类视黄醇也应该通过激活TRPV1来从周围神经末梢释放CGRP。为了测试这种可能性，我们评估了类视黄醇从大鼠结肠节段释放CGRP的能力。与载体相比，AM580、9-顺式-RA或ATRA（30-1000μM）诱发大鼠结肠CGRP释放显著增强（图4A）。引人注目的是，AMG9810（1 μM）的预应用和共应用消除或显著减弱了对AM580、9-顺式-ra或ATRA反应的CGRP释放（图4A）。因此，每一种类视黄醇都能够唤起trpv1阳性神经元的外周感觉神经末梢释放CGRP。

图4.TRPV1介导类视黄醇诱发的CGRP释放和足部肿胀。(A) AM580（30 μM）、9-cis-RA（300 μM）和ATRA（1000 μM）增加了大鼠结肠节段灌注液中的CGRP水平。AMG9810（1 μM）显著降低了所有类视黄醇测试的效果（n = 6）。*P < 0.05和***P < 0.001 vs 对照；+P < 0.05和+++P < 0.001 vs AMG9810。(B)与空白对照组相比，AM580 (100 nmol)、9-cis-RA (100 nmol)和ATRA (600 nmol)各20 μl足底注射显著增加足爪容积，显著增加了爪子体积。足水肿率是类视黄醇引起的足体积增加的百分比。。在Trpv1 - / -小鼠中，AMG9810 (30 mg/kg，腹腔注射)显著减弱或消除了类视黄醇的作用。与对照相比，*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001;与AMG9810相比，++P < 0.05， ++P < 0.01;与Trpv1 - / -相比，#P < 0.05， ###P < 0.001。每种条件下N = 6-10只动物。

众所周知，感觉神经肽，如SP和CGRP，当从感觉神经末梢释放时，会促进血浆外渗和炎症性水肿（19,40）。与这一机制相一致，我们发现足底内给予AM580、9-cis-RA或ATRA（100-600nmol/20μl）可显著增加野生型小鼠的后爪体积（图4B）。AMG9810预处理(30 mg/kg，静脉注射)消除或显著减弱了这种反应（图4B)。此外，在Trpv1-/-小鼠中，类视黄醇诱导的爪体积增加被消除。这些结果表明，类视黄醇以trpv1依赖的方式产生足部肿胀。

类视黄醇会引起有害的疼痛行为

我们接下来问类视黄醇是否能在体内引起有害行为。将AM580、9-cisRA或ATRA注射到小鼠的后爪（40-600nmol/20μl）中，可立即诱导小鼠的伤害行为，包括退缩和舔注射的爪子。有害反应是剂量依赖性的（补充图4）。值得注意的是，在足底内注射各类视黄醇之前30分钟给予AMG9810 (50 mg/kg，腹腔注射)可消除或显著抑制对所有3种类视黄醇的伤害性反应(图5)。（图5）。此外，在Trpv1-/-小鼠中，没有一种类视黄醇引起显著的伤害行为（图5）。因此，类视黄醇在小鼠中诱发trpv1依赖的伤害行为。

图5.通过TRPV1的基因缺失或药理阻断来消融类视黄醇诱导的伤害性反应。每个AM580（100 nmol）、9-顺式ra（100nmol）或ATRA（600 nmol）注射20 μl，产生畏缩和舔舐行为，而在爪内注射维甲酸前30分钟腹腔注射AMG9810（50毫克/千克）可显著减少这种行为。TRPV1功能的基因消融完全消除了类视黄醇引起的有害反应。与对照相比，*P < 0.05，**P < 0.01；与 AMG9810 相比，+P < 0.05；与 Trpv1-/- 相比，#P < 0.05，##P < 0.01。

类视黄醇产生trpv1依赖性的炎症性痛觉过敏

TRP通道可作为有害化学和物理刺激的多模态检测器，并整合来自各种内源性和环境线索的信息（20）。TRPV1在痛觉感受器的外周致敏过程中起着关键作用，并且在急性和慢性炎症性疼痛模型中对热超敏反应至关重要（21,41,42）。因此，我们问，在后爪中注射类视黄醇是否会产生热痛觉过敏，这是用哈格里夫斯方法进行评估的（43）。用爪子注射AM580、9-顺式-RA或ATRA可诱导强劲且持续的热敏反应，以剂量依赖性的方式持续至少120分钟（图6，A-C和补充图5，A-C）。AMG9810（10 毫克/千克，静脉注射）预处理 30 分钟可明显抑制 AM580、9-顺式-RA 或 ATRA 诱导的热刺激下爪退缩潜伏期的缩短（图 6，6，A-C），这与 TRPV1 是类视黄醇诱发热痛行为的介导因子相一致。令人震惊的是，注射 AM580、9-顺式-RA 或 ATRA 所诱发的热痛在 Trpv1-/- 小鼠中完全消失（图 6，6，A-C）。

图 6.药物或基因消减 TRPV1 功能可消除视黄醇诱导的感觉过敏。(A-C）用 AM580（A）、9-顺式-RA（B）或 ATRA（C）处理的动物的热超敏反应时间过程。在 Trpv1+/+ 小鼠体内注射 10 μl 类视黄醇（AM580，2 nmol；9-顺式-RA，3 nmol；ATRA，30 nmol；红色轨迹）可诱导热超敏反应。AMG9810（10 毫克/千克；静脉注射；绿色迹线）可消除某些类视黄醇的作用。在Trpv1-/-小鼠中，类视黄醇诱发的热超敏反应也被取消（蓝色迹线）。与对照相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与 AMG9810 相比，++P < 0.01，++P < 0.001；与 Trpv1-/- 相比，##P < 0.01，###P < 0.001。(D-F）接受 AM580（D）、9-顺式-RA（E）和 ATRA（F）治疗的动物机械异感的时间过程。在 Trpv1+/+ 小鼠体内注射 10 μl 类视黄醇（AM580，2 nmol；9-顺式-RA，3 nmol；和 ATRA，30 nmol；红色迹线）会产生机械过敏，而注射 AMG9810（10 mg/kg；绿色迹线）会消除这种过敏。在 Trpv1-/- 小鼠中，类视黄醇诱发的机械超敏反应也被取消（蓝色迹线）。与对照相比，*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 ；与 AMG9810相比，+P < 0.05, ++P < 0.01, +++P < 0.001；与Trpv1-/-相比，#P < 0.05, #P < 0.01 。请注意，仅注射 10 μl 载体（0.9% 生理盐水；黑色痕迹）时未观察到任何影响。机械和热测试的基线值列表2

越来越多的证据表明，TRPV1也在许多疼痛模型中介导机械超敏反应，包括但不限于膀胱或结肠炎症、骨癌疼痛、镰状细胞病和神经损伤或皮肤炎症后的疼痛（44-47）。因此，我们研究了AM580、9-顺式-ra或ATRA是否通过刺激TRPV1诱发机械性异位痛。事实上，所有3种类视黄醇在足爪注射后以剂量依赖的方式产生了强大的、持续的机械过敏性反应，持续至少90分钟（图6，D-F和补充图5，D-F）。值得注意的是，值得注意的是，TRPV1基因消融或选择性TRPV1拮抗剂AMG9810预处理30分钟，可消除或显著降低AM580-、9-cis-RA-或ATRA诱发的机械超敏反应（图6，D-F）。此外，单独注射载体或AMG9810对基线机械和热响应没有影响（图6和数据未显示）。这些结果表明，TRPV1在体内感知类视黄醇，并介导类视黄醇产生的热敏和机械超敏反应。

RAR拮抗剂是一种有效的TRPV1激动剂，可诱导炎症性痛觉过敏

既往研究表明，pan RAR拮抗剂LE540和选择性RARβγ拮抗剂AGN193109可以抑制维甲酸诱导的刺激反应（14,48）。因此，我们问RARs是否也有助于通过类视黄醇直接激活痛觉感受器。我们检测了LE540和AGN193109对DRG神经元中am580激活的膜电流的影响。出乎意料的是，当单独应用于DRG神经元时，LE540和AGN193109都激活了较大的膜电流（补充图6，A-C）。用AMG9810预处理后，这两种反应都被消除了，这表明LE540和AGN193109，像其他结构相关的类视黄醇一样，确实是有效的TRPV1激活剂（补充图6，A-C）。与这些发现相一致的是，LE540和AGN193109都以浓度依赖性的方式激活了重组TRPV1（补充图6，D-F）。我们进一步使用钙成像来确定LE540和AGN193109是否能在DRG神经元中诱发Ca2+内流。LE540在约5%的DRG神经元中产生了[Ca2+]i反应。TRPV1功能的基因消融完全消除了le540诱导的[Ca2+]i反应（补充图6，G-I，数据未显示）。对AGN193109的反应无法测量，因为当给负载Fura-2的DRG神经元时存在大量的伪影，可能是由AGN193109和Fura-2之间的直接相互作用引起的。接下来我们评估了爪注射LE540或AGN193109对热痛行为的影响。LE540和AGN193109均可引起持续60至90分钟的热痛觉过敏，而TRPV1功能的药物或基因消融均完全消除了热痛觉过敏（补充图7，A和B）。这些结果提供了我们所认为的LE540和AGN193109通过TRPV1直接激活痛觉感受器的第一个证据。综上所述，我们的研究结果支持了一个模型，即包括RAR拮抗剂在内的多种类视黄醇激活TRPV1以产生疼痛和炎症，而这些疼痛和炎症独立于视黄酸敏感的核受体活性。

类视黄醇通过“香草酸结合袋”激活TRPV1

虽然TRPV1整合了许多产生疼痛的化学和物理刺激，但不同的模块结构域通过不同的模式参与了TRPV1的激活（49）。辣椒素和树脂毒素（RTX）绑定到“香草酸结合口袋”在胞质侧启动TRPV1门而细胞外质子和Mg2+与酸性残留TRPV1胞外孔循环（50、51），在几个特定的氨基酸残基也需要赋予热敏感性TRPV1(图7)。与小鼠和人的TRPV1相比，在HEK293T细胞中表达的鸡TRPV1对AM580不敏感，但对酸保持敏感性（图7B和补充图8）。这让人想起了鸡的TRPV1对辣椒素和结构相关的类似物的不敏感性（53）。香草素结合袋由面向细胞质的残基（R115、E762）组成，它们位于脂质双分子层的内小叶内（Y512、S513、M548和T551）(图7A)。携带Y512A或S513Y残基的突变体对辣椒素的敏感性显著降低，而没有改变质子激活（53）。因此，我们研究了这些突变体是否也表现出对类视黄醇的敏感性的改变。在Y512A、S513Y、T550I、Y512A/S513Y和Y512A/S513A突变体中，am580激活的电流显著降低（图7C）。在这些突变体中，AM580的EC50值至少增加了10倍（图7C和补充图9，A-C）。同样，在Y512A和S513Y突变体中，9-顺式-ra激活的电流也显著降低，而在蛋白磷酸化严重受损的S503A突变体中则没有显著降低（54）（图7D）。在突变体S513A、M548L和T550I中，AM580的EC50值也有所增加，但没有Y512和S513突变体那么多（图7C）。另一方面，在蛋白质磷酸化位点中断的TRPV1突变体中，质子和热激活并不影响am580诱导的反应（图7A，补充图9和补充表3）。这些结果表明，香草酸与TRPV1结合所需的结构元件对类视黄醇与TRPV1的相互作用也是必不可少的。

图7.TRPV1的香草酸结合袋赋予了类视黄醇敏感性。(A)示意图显示了辣椒素（蓝色圆圈）、蛋白磷酸化（绿色圆圈）、质子（黄色圆圈）和热（紫色圆圈）激活/调节TRPV1所需的结构元素。(B)具有代表性的I-V曲线显示，鸡TRPV1被pH 4.3激活，而不是AM580或辣椒素（n = 5）。非选择性TRP通道阻滞剂钌红（RR）消除了向内的质子激活电流，而不是向外的质子激活电流。(C)定量分析野生型或香草酸结合袋被破坏的TRPV1突变体中-60mV时am580激活电流的EC50值。在TRPV1 Y512A或S513Y突变体中，(D)9-顺式-ra激活（30 μM）膜电流（-60mV）几乎消失，而S503A突变体没有（每个条件下n=4-7）。

讨论

广泛用于皮肤疾病和癌症治疗的类视黄醇，在局部或全身应用时，可引起毒性，并产生与人体灼烧、瘙痒和炎症相关的感觉超敏反应（6-8,13）。口服或鞘内应用维生素A衍生物也被证明会增加有或没有组织炎症的啮齿动物的有害反应（14,15）。然而，类视黄醇信号在疼痛通路中的细胞和分子基础尚未被探索。在这项研究中，我们调查了类视黄醇的兴奋作用在疼痛TRPV1通道和发现TRPV1是一个主要分子目标自然发生和合成类视黄醇，和TRPV1是必要和充分的激活主要痛觉感受器和类视黄醇诱发感觉过敏，最令人信服的结果遗传或药理消融TRPV1功能。我们的工作表明，这一信号通路能够独立于基因调控产生类视黄醇的刺激副作用。

疼痛是由多个层次的神经信号的复杂处理引起的（21）。在痛觉感受器的外周和中央末端的TRPV1是引发瘙痒和疼痛感觉的关键因素之一（55）。类视黄醇激活和敏感痛觉感受器应引起疼痛和神经源性炎症。事实上，我们的研究结果表明，在临床剂量范围内的类视黄醇，会产生强大的热和机械致敏反应。TRPV1介导的对外源性类视黄醇的反应可能产生刺激或轻度疼痛，这可能是对过度暴露类视黄醇的警告反应，特别是在预先存在的炎症状态下，TRPV1功能上调，如痤疮或敏感和衰老的皮肤（56-58）。

虽然我们还没有研究内源性类视黄醇在TRPV1调控中的可能作用，但我们发现TRPV1作为类视黄醇的离子性受体，这提出了TRPV1是否也能感知内源性类视黄醇的问题。维生素A以视黄醇酯（REs）的形式储存在肝脏中，并以视黄醇与视黄醇结合蛋白（rbp）结合的形式传递到血液中（59）。事实上，类视黄醇在脊髓和大脑中高度富集，而中枢神经系统似乎通过一种未知的机制比其他组织更有效地合成类视黄醇（60）。类维生素黄参与脊髓神经元的发育，促进脊髓损伤诱导的运动功能障碍的恢复（61）。类视黄素在糖尿病患者的轴突生长、伸长、再生、髓鞘形成、神经可塑性和周围神经病变等方面也发挥重要作用。我们的研究结果表明，9-cis-RA和ATRA是体内外激活TRPV1的有效内源性类视黄醇，并在足底注射后产生神经源性炎症和感觉超敏反应。炎症和神经损伤过程中内源性类视黄醇代谢的改变可能会改变TRPV1的功能，从而参与痛觉、异位性痛觉和痛觉过敏（64）。

我们的研究结果表明，香草酸结合袋是TRPV1激活所必需的，它的破坏导致维甲酸激活TRPV1的效力降低。因此，我们不认为类视黄醇通过TRPV1直接激活表皮角质形成细胞，因为角质形成细胞对香草素具有抗性（65）。另一方面，类视黄醇信号也可以间接调节TRPV1的功能。例如，ATRA处理增强了表达TRPV1的SHSY5Y神经母细胞瘤细胞中TRPV1蛋白的表达和功能（66）。类视黄素信号也可以影响其他促炎介质的水平，如NGF和前列腺素，这些介质可以改变糖尿病等疾病条件下的疼痛感（62,67）。

在我们对类视黄醇激动剂和拮抗剂的表征中，我们发现AGN193109和LE540,2 RAR拮抗剂，是有效的TRPV1激活剂，并以TRPV1依赖的方式激发初级痛觉感受器引起热超敏反应。AGN193109和LE540都是类视黄醇类似物，可以结合但不激活RARs，因此对RARs显示出拮抗剂活性（68,69）。考虑到rar和TRPV1的配体结合袋的差异，这个结果并不令人惊讶。AGN193109和LE540激活TRPV1的有效性可能是由于它们与TRPV1激活的类视黄醇结构相似（补充图2）。类似地，最近的一份报告显示，一种与LPA结构相似的LPA受体拮抗剂也能激活TRPV1（25）。从这些发现来看，应用这些药物可以抑制RAR活性，同时激活TRPV1。然而，矛盾的是，有报道称这些RAR拮抗剂可以抑制维甲酸诱导的刺激（14,48）。对这一悖论的一种可能的解释是，抑制源于TRPV1的脱敏，而不是抑制类视黄醇核受体。我们已经证实，辣椒素等TRPV1激活剂会导致TRPV1脱敏（70），我们还发现，本研究中使用的类视黄醇激动剂也会导致脱敏（补充图3，数据未显示）。预应用RAR受体拮抗剂和/或共同应用可能会脱敏和减弱随后应用类视黄醇引起的刺激作用，因为它们都激活TRPV1。

综上所述，本研究表明TRPV1是一种离子性类视黄醇受体，介导类视黄醇诱发的痛觉感受器的激活，并为解释类视黄醇诱导的毒性现象提供了一个合理的机制。我们的研究结果进一步揭示了TRPV1所感知到的引发神经源性炎症和感觉超敏反应的有害信号的多样性。这些研究指出了我们认为的类刺激副作用的新治疗靶点，可以受益于选择性TRPV1拮抗剂的可用性。虽然全身应用TRPV1拮抗剂有抑制疼痛的作用，但它会在包括人类在内的许多物种中引起热疗（71）。最近的研究表明，抑制质子与TRPV1的结合可能是TRPV1阻断剂诱导热疗的机制（72）。新的抑制TRPV1质子激活的阻滞剂可能是有效和安全的药物，可用于治疗疼痛和炎症（73）。此外，局部应用而不是全身应用TRPV1拮抗剂可能是一种有吸引力的方法，以抑制类视黄醇诱导的局部刺激而不引起热疗。此外，TRPV1功能的外周操纵不应改变核受体的激活，这增加了TRPV1作为治疗靶点的前景，以减少临床使用类视黄醇引起的炎症和疼痛。

文章链接：

https://doi.org/10.1172/jci66413

封面来源：

https://www.newbeauty.com/guide-to-retinol-and-reinoids/

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwMDAzOTg5NQ==&mid=2247498358&idx=1&sn=85b28722a5f1d06d78bd197b76ede315

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