iMetaOmics | 清华刘晓组和复旦王久存组揭示特定细菌在皮肤老化中的作用

培养和非培养方法揭示特定细菌在人类皮肤老化中的作用

●  利用鸟枪法宏基因组测序数据集分析了与年龄和衰老表型相关的皮肤微生物组动态；

●  通过机器学习建模，预测奥斯陆莫拉菌Moraxella osloensis和痤疮丙酸杆菌Cutibacterium acnes是早衰/延迟衰老相关的微生物物种；

●  从健康皮肤中分离出的奥斯陆莫拉菌Moraxella osloensis在体外调节胶原蛋白代谢和细胞外基质组装；

●  与细菌群落相比，年龄对真菌群落变化的影响相对较小。本研究分析了与年龄相关的真菌类群。

皮肤上有数百万种不同的微生物，包括细菌、真菌和病毒，统称为人类皮肤微生物组。这些共生菌对维持皮肤平衡非常重要，皮肤微生物组的破坏与一些最常见皮肤病的各种临床症状有关。然而，对皮肤微生物组-表型相互作用的理解仍然模糊不清，需要系统的特征描述。皮肤老化是一个动态过程，在外观和功能方面会出现一系列与年龄相关的表型变化，人体“肤龄”可能与时序年龄有很大偏差。因此是研究微生物组-表型相互作用的理想模型。尽管许多研究已经证实了时序年龄对皮肤细菌群落的影响，但对皮肤衰老引起的跨界微生物群变异的了解仍然很少。

为了探索跨界微生物组与皮肤表型的相互作用，研究人员从上海招募了294名健康人。研究人员收集了前额（FH）、面颊（CK）和鼻旁（NS）三个面部部位共822个皮肤微生物样本。利用鸟枪法宏基因组测序技术进行评估，从而对所有微生物群（细菌、真菌和病毒）进行了更精确的调查。研究人员交叉分析了多种潜在的宿主变量，包括年龄、性别和 12 种皮肤表型，以阐明健康中国个体中宿主与微生物群之间的相互作用。与以往的研究相比，本研究更进一步；除了探讨衰老与微生物群的相关性外，还使用二维（2D）培养体系来验证了这些关联。研究的一般工作流程如图 1A 所示。

图1. 研究流程、相关性分析和微生物组成的影响

(A) 本研究的整体工作流程；(B) 表型参数与年龄之间的斯皮尔曼相关性。FH：前额；CK：脸颊；NS，鼻旁。L* = 皮肤暗度/亮度；a* = 红斑；b* = 晒黑。L* 值的增加表示从黑色向白色过渡，而 a* 值则从绿色向红色过渡，b* 值则从蓝色向黄色过渡。蓝色表示负相关。“o "表示由于鼻旁解剖学限制而缺少经表皮失水（TEWL）、水合作用、皮脂、pH 值和弹性方面的数据。颜色条代表相关值。斯皮尔曼相关性的显著性水平为：*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001；(C) 柱状图说明了各变量对细菌、真菌和病毒组成的影响大小。图中显示了对物种有显著影响的变量。校正后的 R² 值代表变量解释的微生物组成变化的比例。不同颜色代表不同界别。部分用 BioRender.com 制作。

研究发现，年龄对皮肤外观和生理有重要影响（图 1B）。使用置换多元方差分析结果显示，除了卟啉外，年龄是对细菌最有影响力的因素（图 1C）。而后，研究人员分析了三个不同年龄组的细菌动态（图 2A）。总体而言，细菌多样性和变异性随着年龄的增长而增加（图 2B，2C）。基于距离的冗余分析表明，不同年龄组的微生物物种之间存在明显的分离（图 2D）。研究人员还发现了58 种与年龄相关的细菌种类。值得注意的是，痤疮丙酸杆菌   Cutibacterium acnes与年龄呈负相关，奥斯陆莫拉菌   Moraxella osloensis与年龄呈正相关（图 2E，2F）。

图2. 细菌群落在衰老过程中的动态变化

(A) 不同年龄组：年轻组（20至35岁，N = 74），中年组（36至50岁，N = 131），老年组（50岁以上，N = 89）；(B) 在衰老过程中，细菌群落的α多样性略有增加。使用Wilcox检验确定显著性；(C) 三个年龄组之间细菌群落的β多样性存在差异。使用Wilcox检验确定显著性；(D) 基于距离的冗余分析（dbRDA）展示了不同年龄组之间细菌群落组成的差异。每个点代表一个样本。颜色代表年龄组。形状代表不同部位。线条代表不同年龄；(E) 细菌类群与年龄之间的关联。颜色代表三个部位：绿色为CK，橙色为FH，紫色为NS；(F) 与年龄相关的物种共现网络。节点代表与年龄相关的物种。节点颜色代表门（phylum）。红色线条表示正相关，蓝色线条表示负相关。

图3. 细菌、真菌与表型参数之间的相关性

热图展示了前额皮肤中前20种细菌 (A) 和前10种真菌 (B) 的丰度与皮肤表型参数之间的Spearman相关性。蓝色表示负相关；红色表示正相关。Spearman相关性中的显著性水平为：*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001。

图4. 早衰组与延缓衰老组之间微生物组成和功能的差异

(A) 使用多元线性回归 (MLR) 模型预测皮肤年龄。红色表示属于早衰组；蓝色表示属于延缓衰老组；(B) FH、CK 和 NS 部位年轻皮肤组与老年皮肤组之间的微生物组成差异。红色表示在老年皮肤组中富集的细菌；蓝色表示在年轻皮肤组中富集的细菌；(C) FH、CK 和 NS 部位早衰组与延缓衰老组之间细菌功能特征的差异。柱状图展示了差异性的KEGG模块的相对丰度。红色表示在早衰组中富集的模块；蓝色表示在延缓衰老组中富集的模块。

图5. 与三种皮肤细菌共培养的角质形成细胞和成纤维细胞的基因表达情况

(A) 皮肤细胞被细菌上清液刺激的示意图。对HaCaT细胞和原代真皮成纤维细胞进行RNA-seq分析，这些细胞在用M. osloensis、C. acnes和S. epidermidis的上清液（分别在R2A、RCM或LB培养基中培养，OD600 0.8-1.0，n = 3）刺激24小时后进行分析。以细菌培养基（R2A、RCM或LB）刺激的细胞作为对照组；(B) 基因本体（GO）富集分析显示了用M. osloensis的细菌上清液处理的HaCaT细胞中前10个富集通路（p < 0.05）；(C) 通过定量PCR（qPCR）分析M. osloensis、C. acnes和S. epidermidis的上清液分别刺激HaCaT细胞24小时后几种基质金属蛋白酶（MMPs）的基因表达（*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001，数据汇总自n = 3次独立实验）；(D)和(E)为三个微生物物种的上清液分别处理过的HaCaT细胞（D）和成纤维细胞（E）中的衰老相关基因表达变化的热图（校正后的p < 0.05）。灰色条表示相应的基因没有进一步的子分类。

与对细菌群落的重大影响相比，年龄对真菌群落变化的影响较小 。然而，不同年龄组之间的真菌组成仍存在一些差异。老年组的真菌 α多样性高于年轻组（图 6A，6B），年轻和中年组真菌群落组成差异明显大于老年组（图 6D）。主坐标分析显示，按年龄对真菌群落进行分组具有统计学意义（图 6C）。使用Wilcoxon秩和检验，确定了与年龄相关的真菌物种（图 6E）。大多数差异真菌与年龄呈正相关，而与卟啉和皮脂水平呈负相关（图 6F）。

图6. 三个年龄组中真菌群落的动态变化

(A) 真菌群落中α多样性与年龄的Spearman相关性分析；(B) 箱线图比较了年轻组（20−35岁，N = 74）、中年组（36−50岁，N = 131）和老年组（> 50岁，N = 89）之间真菌α多样性的差异。使用Wilcoxon检验确定显著性；(C) 基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示了不同年龄组中每个个体的真菌群落在物种水平上的分布。每个年龄组内的样本通过95%置信椭圆聚类。使用PERMANOVA检验确定显著性；(D) 三个年龄组之间真菌群落的β多样性。通过物种水平上两个样本之间的Bray-Curtis距离来测量群落组成的相似性；(E) 使用Wilcoxon秩和检验确定年轻组和老年组之间真菌组成的差异。红色柱状条表示在年轻组中富集的真菌，蓝色柱状条表示在老年组中富集的真菌；(F) 热图展示了(E)中差异真菌与13个宿主因素之间的Spearman相关性分析。统计显著性如下表示：*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001。

结  论

在本研究中，通过对鸟枪法宏基因组测序结果的解释，并辅以依赖培养的方法，研究人员更好地了解了人类皮肤微生物群落的组成、多样性和变异性，甚至提供了一些有关功能和机理属性的相关信息。在本研究中，研究(i) 分析了与年龄/表型相关的皮肤微生物组动态，(ii) 预测了与早衰/延迟衰老相关的微生物物种，主要是 M.osloensis 和 C. acnes，(iii) 在体外验证了一些宿主-微生物相互作用的生物学功能。

总之，目前的研究已经超越了皮肤上存在哪些微生物的问题，而是评估它们的功能与对皮肤影响之间的联系。研究系统地描述了皮肤微生物组-表型组关联网络，尤其是衰老表型。此外，研究还通过体外功能实验验证了一些预测的关联，因为深入了解衰老过程的分子通路对于设计针对各种年龄相关的皮肤状况的干预策略非常重要。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！