Nature子刊：蛋白组+代谢组=构建心肌病调控功能网络并提供在线应用程序

本次解读的是发表在Nature Communications（IF=14.7）上的一篇文章《Core functional nodes and sex-specific pathways in human ischaemic and dilated cardiomyopathy》，本研究利用一个精心收集的大型冷冻保存的人类左心室心肌组织生物库，对缺血性心肌病 (ICM) 和扩张性心肌病 (DCM) 的分子机制进行了深入研究。研究人员对来自 44 颗人类 ICM 和 DCM 心脏的 51 个左心室 (LV) 样本进行了无偏深度蛋白质组学和代谢组学分析，并与年龄、性别和 BMI 匹配的、组织病理学正常的供体对照组进行了比较。研究结果揭示了 ICM 心脏中血清淀粉样蛋白 A1 (SAA1) 的显著减少，甲状腺激素信号通路紊乱，以及两种疾病中氧化还原酶辅因子核黄素-5-单磷酸 (FMN) 和糖酵解中间体果糖-6-磷酸 (F6P) 的显著减少。此外，研究还发现了心衰的性别特异性变化，包括一氧化氮相关的精氨酸代谢、线粒体底物以及 X 染色体相关的蛋白质和代谢物变化。研究人员还提供了一个交互式在线应用程序 (https://mengboli.shinyapps.io/heartomics/)，作为公开的资源库。

心力衰竭 (HF) 是一个主要的全球健康问题，其病因和发病机制复杂，涉及遗传易感性和环境因素的相互作用。缺乏用于研究的人类左心室心肌组织是研究心力衰竭发病机制的一个主要限制。缺血性心肌病 (ICM) 和扩张性心肌病 (DCM) 是全球范围内导致心力衰竭最常见的两种病因，分别由心肌缺血和左心室扩张及收缩功能障碍引起。尽管 ICM 的病因明确（心肌缺血），并且缺血后重构已被充分描述，但疾病的进展仍然高度可变且不可预测。DCM 的核心特征是左心室扩张和收缩功能障碍，而无冠状动脉疾病和异常负荷情况，其潜在病因包括遗传、炎症、代谢、浸润和自身免疫因素。尽管对 DCM 和 ICM 进行了广泛的研究，但驱动 DCM 的分子机制在很大程度上仍然难以捉摸，并且不同病因导致共同的 DCM 表型的原因也知之甚少。以往研究 DCM 和 ICM 外植心脏的功能基因组特征主要集中在上游领域，包括全基因组测序、转录组分析，有时还包括蛋白质表达。这项工作为了解人类心力衰竭的分子变化提供了新的见解，表明细胞外基质重塑、炎症信号传导、氧化应激、线粒体功能障碍和支链氨基酸代谢是特征性的致病变化。然而，蛋白质组学研究通常使用少量样本，很少超过一种病因，并且在年龄、性别和 BMI 方面没有进行匹配。此外，上游扰动是否通过翻译传播到蛋白质水平，并通过酶促加工进一步传播到代谢物水平，需要进一步了解。此类分析需要大量的样本，以及匹配的对照（非疾病）组，以充分解决年龄、性别和体重指数 (BMI) 的主要混杂因素。因此，本研究旨在使用对年龄、性别和 BMI 匹配的组织病理学正常的供体对照进行无偏差、全面的大量心力衰竭样本筛查，从而确定蛋白质和代谢物通路水平的 ICM 和 DCM 的扰动。

数据来源: 研究人员使用了一个大型人类心脏生物样本库，其中包含在过去 30 年中精心收集的冷冻保存的左心室心肌组织。样本来自因各种原因（包括运输物流、供体-受体大小不匹配和免疫不相容性）而未用于心脏移植的供体心脏，以及来自接受心脏移植的心力衰竭患者。所有心力衰竭患者均为 NYHA III/IV 级，左心室收缩功能严重受损（射血分数降低）。供体样本的组织学分析显示结构正常。左心室样本取自供体和心力衰竭患者，并在手术室立即快速冷冻 (-196°C)。所有样本从采集时起就储存在-170 至-180°C 的悉尼心脏库中。共收集了来自 44 颗人类心脏的 51 个左心室心肌样本，其中包括 15 例供体、15 例 ICM 和 14 例 DCM，并在年龄、性别和 BMI 方面进行了匹配。(表 1，图 1)

蛋白质组学分析:

样本制备: 心肌组织在含有 8M 胍、100mM Tris (pH 8.0)、10mM Tris(2-羧乙基)膦和 40mM 2-氯乙酰胺的缓冲液中通过探针超声处理进行裂解，并在 95°C 加热 5 分钟。裂解物经离心后用水 1:1 稀释，蛋白质用丙酮沉淀，并用胰蛋白酶和 LysC 进行酶解。

肽段标记和分离: 将酶解后的肽段使用 TMTpro 16plex 试剂进行标记，然后使用反相色谱法进行分离。

质谱分析: 使用配有 FAIMS Pro™ 的 Dionex 3500 超高效液相色谱 (UHPLC) 和 Orbitrap Exploris 480 质谱仪进行数据非依赖性采集 (DIA) 质谱分析。

蛋白质定量: 使用内部生成的肽段谱图库对 DIA 数据进行分析，并使用基于 MS2 的提取离子色谱图进行定量。

数据处理: 使用 Perseus 软件对数据进行 log2 转换和中位数标准化。

代谢组学分析:

样本制备: 将冷冻的心脏组织在液氮中研磨成粉末，并称重用于代谢组学 (~150 mg) 和蛋白质组学 (~20 mg) 分析。

代谢物提取: 使用液氮研磨组织，并使用适当的溶剂提取亲水性和疏水性代谢物。

靶向代谢组学分析: 使用配备 QTRAP5500 质谱仪的 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统，以正离子和负离子模式测量代谢物。使用亲水相互作用色谱法 (HILIC) 分离极性代谢物。使用多反应监测 (MRM) 方法对 126 种合成代谢物进行靶向分析。

数据处理: 使用 MultiQuant 3.0 软件对 MRM 数据进行峰面积积分，并将峰面积标准化到内参中。

生物信息学和统计分析:

差异表达分析: 使用 limma R 包中的 lmFit 和 eBayes 函数进行差异表达分析，并使用 Benjamini-Hochberg 方法对 p 值进行校正。

通路分析: 使用 KEGG 数据库进行通路富集分析，并使用 pathview R 包生成通路图。

网络分析: 使用 igraph R 包进行成对相关网络分析，以识别共调控的节点。节点大小与特征向量中心性成正比，边的粗细与 Pearson 相关系数成正比。仅显示 Pearson 相关系数大于等于 0.7 的边。

性别特异性分析: 通过拟合交互作用模型来检测受性别影响的蛋白质和代谢物。

统计软件: 使用 R (v3.5.2) 进行所有统计分析。

蛋白质组学分析: 在 ICM 心脏中，血清淀粉样蛋白 A1 (SAA1) 的水平降低了 10 倍 (P = 2.8 × 10⁻⁷)，在 DCM 心脏中也显著降低。在 ICM 和 DCM 心脏中均观察到许多细胞外基质 (ECM) 蛋白的表达发生改变，包括胶原蛋白、骨粘连蛋白、纤连蛋白和肌腱蛋白等。此外，转铁蛋白和血管性血友病因子 (vWF) 在 ICM 和 DCM 心脏中均显著升高。在 ICM 心脏中，参与血液凝固级联反应的蛋白，如 kallistatin、肝素辅因子 II 和激肽原 1，也显著上调。(图 2, 表 2, 表 3)

代谢组学分析: 在 ICM 和 DCM 心脏中，氧化还原酶辅因子 FMN 的水平降低了约 2 倍。2-甲基丁酰肉碱在 ICM 和 DCM 心脏中均显著降低，提示线粒体应激和心肌底物利用的变化。甲状腺素在 ICM 和 DCM 心脏中均显著升高。生物素和胍基乙酸在两种类型的心脏中也均升高。果糖-6-磷酸在 ICM 和 DCM 心肌中显著降低。ICM 中的其他差异代谢物包括三甲胺-N-氧化物 (TMAO) 和血清素的升高，以及脱氧核糖-5-磷酸和瓜氨酸的升高。在 ICM 和 DCM 心脏中，一些嘌呤核苷酸发生了显著变化，包括胞苷、胞嘧啶和脱氧胞苷的升高，以及 N-乙酰-L-丙氨酸的降低。嘧啶核苷酸尿苷在 ICM 和 DCM 心脏中均升高。(图 3, 表 4, 表 5)

通路分析: 在 ICM 和 DCM 心脏中，氧化磷酸化通路、补体和凝血级联通路以及糖酵解通路均显著富集。在 ICM 心脏中，TCA 循环、碳水化合物代谢和丙酮酸代谢通路也显著富集。在 DCM 心脏中，脂肪酸延长/脂肪生成通路、胆固醇代谢和脂肪消化通路显著富集。(图 4)

网络分析: 网络分析显示，在 ICM 心脏中，ECM 相关蛋白、补体和凝血相关蛋白以及细胞骨架相关蛋白是主要的功能节点。在 DCM 心脏中，ECM 相关蛋白占主导地位。(图 5a, 5b)

性别特异性差异: 在 ICM 心脏中，AP1M1 和 FRY 蛋白的表达在男性心脏中显著降低，而 HNRNPH2 蛋白的表达显著升高。组氨酸、2-甲基丁酰肉碱和鸟氨酸在男性 ICM 和 DCM 心脏中均发生改变。在男性 ICM 心脏中，半胱胺、精胺、2-脱氧胞苷、色氨酸、胞嘧啶、酪氨酸、ADMA 和对氨基苯甲酸水平升高，而 ATP 水平降低。在男性 DCM 心脏中，EXOC1 蛋白表达升高，而 ANXA3 蛋白表达降低。NG-单甲基-L-精氨酸在男性 DCM 心脏中升高。(图 5c, 5d, 5e)

样本量: 虽然研究使用了相对较大的样本量，但仍然有限，尤其是在 DCM 组中。更大的样本量可以提高研究结果的统计效力，并更好地识别细微的蛋白质组学和代谢组学变化。

组织异质性: 左心室心肌组织可能存在异质性，这可能会影响蛋白质组学和代谢组学分析的结果。未来的研究可以考虑使用单细胞分析技术来研究不同细胞类型的心力衰竭分子机制。

临床数据: 研究中并未包含所有潜在的混杂因素，例如药物治疗史、合并症的严重程度和生活方式等，这些因素可能会影响心力衰竭的分子机制。未来的研究需要收集更全面的临床数据，以更好地控制混杂因素。

机制研究: 这项研究主要集中于描述 ICM 和 DCM 的蛋白质组学和代谢组学特征，但并未深入探讨这些变化背后的分子机制。未来的研究需要进行更深入的机制研究，以阐明导致心力衰竭的分子通路和关键调控因子。 

小编说明:

本研究利用深度蛋白质组学和代谢组学分析，揭示了人类 ICM 和 DCM 心脏中关键的功能节点和性别特异性通路。研究结果不仅证实了已知的 HF 发病机制，还发现了一些新的潜在治疗靶点，例如 SAA1、FMN、嘌呤和嘧啶核苷酸、甲状腺素以及一些性别特异性的代谢物。交互式在线应用程序的提供也为其他研究人员提供了宝贵的资源。然而，由于样本量、组织异质性和临床数据等方面的局限性，未来的研究需要进一步验证和扩展这些发现，并深入探索潜在的分子机制，以开发更有效的心力衰竭治疗策略。

临床研究的根本使命是发现并解决生命科学领域亟待解决的临床问题，同时，为即将发生的临床难题提供备选解决方案。

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