对哺乳动物细胞进行补料分批培养是重组蛋白商业化生产最常见的方法。然而，由于在培养过程中会产生大量的铵和乳酸、另外由于营养限制碱的添加引起的高渗应激等因素，使得细胞的生长密度受到限制。为了尽量克服这些因素，我们研究了一种简单的方法来减少铵和乳酸的产生，称之为乳酸补充和适应（LSA）技术：通过使用含有乳酸的培养基来驯化CHO细胞。使用这种简单的方法，实现了乳酸产量减少近100%，同时批培养摇瓶中的铵产量减少了50%。在随后的补料分批生物反应器培养中，乳酸产量和碱添加量都减少了八倍。活细胞密度达到35x10^6 cells/mL，总活细胞密度达到273x10^6 cells/mL/day，均为目前报道的补料分批动物细胞培养的最高值。研究LSA技术在动物细胞培养过程中的应用，有助于开发更有利于先进工业应用的工艺条件。
降低乳酸和铵产生的方法总结
在动物细胞培养领域，许多研究人员观察到乳酸和铵积累到抑制细胞生长和生产力的水平。60多年来，已经开发了许多方法来减少乳酸和铵的产生。常见方法的总结如表1所示。大约在过去的35年里，随着生物制药行业从低密度分批培养转向高密度补料分批培养，乳酸和铵积累的挑战大大增加。通过工业动物细胞培养制造人类治疗药物的理想方法是：（1）在所有与工业相关的细胞系和工艺中，普遍有效地将乳酸和铵的产量降低到足够低的水平，从而对细胞生长和产品质量没有负面影响，（2）不会增加甚至可能降低工艺复杂性，如下文进一步讨论的那样，以及（3）通常在根据现行良好生产规范（cGMP）运行的大规模工业运营中实施，多年来取得了良好的成功记录。
如表1所示，并在下面进一步讨论，目前的方法都不符合这三个标准。
表1中显示的许多最早的方法，如用替代糖代替葡萄糖，都是为了减少乳酸的积累而开发的。当时，人们没有广泛认识到铵积累可能是一个问题，因此没有报告有关铵水平的数据（NR）。事实上，许多最早的方法，以及许多目前的方法，都减少了乳酸的产量，但增加了铵的产量，或者充其量，肯定没有被证明可以普遍减少氨的产量。当在补料分批培养中进行测试时，半乳糖等替代糖有时会导致与葡萄糖类似的生长，但通常不会。
相对较低水平的铵，通常在2至10 mM之间，可能对细胞生长和生产力产生负面影响，也可能对某些重组糖蛋白的糖基化，甚至可能对其生物活性、稳定性和/或免疫原性产生负面影响。翻译后修饰的变化被认为与细胞内pH值的增加有关，这是由氨转运到高尔基体和/或能量消耗引起的。由于这些原因，铵是动物细胞培养中最重要的抑制代谢物之一。铵的负面影响通常在浓度比乳酸盐（例如20-40mM）低约十倍（例如2-4mM）时产生。因此，以氨的微小增加为代价来减少乳酸肯定是不可取的。
将培养基中的葡萄糖控制在低水平，以限制葡萄糖向细胞的供应，已经被用于减少乳酸的产生超过三十年（表1）。这可以通过各种方式实现，例如直接测量和自动或手动反馈控制葡萄糖水平。当葡萄糖而非谷氨酰胺被控制在低水平时，葡萄糖摄取和乳酸产生通常会出现理想的减少，但这通常与谷氨酰胺摄取和铵生产的不理想增加同时发生。因此，为了尽量减少乳酸和铵的产生，可能需要同时控制葡萄糖和谷氨酰胺或更换。
工艺复杂性和缺乏工业实施
自从Fleischaker的开创性工作以来，发现需要低至0.1mM的葡萄糖水平才能在很大程度上消除乳酸的产生，对用于葡萄糖和/或谷氨酰胺自动反馈控制的系统进行了多次改进。这导致学术或工业过程开发小组发表了一系列有趣的出版物。也就是说，许多反馈控制方法需要以下四个组成部分：（1）频繁提取样本，通常使用自动取样系统，（2）使用外部传感器系统对葡萄糖和/或谷氨酰胺水平进行样本测试，（3）将测试结果传输到计算机控制系统进行处理，以及（4）使用泵和传输线从葡糖和/或谷氨酸储器中频繁添加培养物。
当将上述四个部分添加到培养系统中时，过程复杂性会大大增加。
尽管具有上述四个组成部分的复杂系统已在实验室规模的生物反应器中多次成功使用，并在学术界和工业界的实验室规模上一再显示出实质性的好处，但据我们所知，它们从未作为许可的大规模动物细胞培养过程的一部分实施。即使对于持续时间仅为1-2天的大肠杆菌生产培养物，在大规模cGMP操作中持续喂食营养素也存在重大挑战。对于动物细胞生产培养，持续时间通常至少为10-15天，这些挑战会增加，因为系统必须在更长的时间内连续运行而不会出现问题。运行失败的可能性被认为太高，不仅是因为系统的复杂性，还因为在“接近失败”的营养水平下，污染和强有力的反馈控制带来的风险。葡萄糖耗竭可导致细胞凋亡和过早细胞死亡，或通过减少糖基化影响产品质量。因此，大多数工业补料分批过程的葡萄糖水平保持在1 g/L或更高以上，远高于减少乳酸产量所需的较低范围。
Gagnon等人最近提出的一种方法，即HI端pH控制葡萄糖输送（HIPDOG），已被证明可以在不使用外部传感器系统和频繁取样的情况下显著减少乳酸的产生，并显著提高滴度。该策略依赖于pH控制回路在pH值升高时输送葡萄糖。该方法需要为每种培养物使用pH传感器、进料输送管线、泵和葡萄糖进料罐，增加了每种培养系统的复杂性。因此，对于大量非常小规模的培养物，如用于细胞系筛选的培养物来说，很难实施。然而，它不需要频繁取样培养液进行葡萄糖和/或谷氨酰胺分析，因此不会增加相关的污染和传感器故障风险。对于大规模文化，HIPDOG提供的性能提升显然值得增加复杂性。它已在工业cGMP细胞培养中实施，已被用于大幅改进传统工艺，并提供了迄今为止最好的补料分批培养性能。除辉瑞公司外，没有其他公司发布的实施报告。然而，与许多其他低血糖控制系统一样，这种方法会导致峰值铵水平的增加。因此，如果与谷氨酰胺合成酶转染的中国仓鼠卵巢（GS-CHO）系结合使用，HIPDOG方法的成功率可能会提高。谷氨酰胺合成酶（GS）转染对CHO和NSO系都有效，并且可能普遍有效。它不仅为细胞系提供了高比生产率，而且是一种减少氨产生的代谢工程方法。当与HIPDOG结合使用时，GS技术通常可以将铵保持在可接受的范围内。
还有其他动态营养喂养的方法，例如依赖于频繁测量氧气摄取率和许多其他培养参数的方法。这些测量值与各种化学计量和/或其他数学模型结合使用，以确定最佳进料量和/或配方。尽管这些方法不需要频繁采样来测量和反馈控制葡萄糖和/或谷氨酰胺，但它们仍然增加了相当程度的过程复杂性，因此很少在cGMP操作中完全实施。某些方面，如培养基和进料的化学计量设计，通常用于现代工艺。
代谢工程
许多研究人员试图开发代谢工程方法来减少乳酸和/或铵的产生。为了限制本介绍的范围，表1中没有引用这些方法。没有一个符合本小节第一段中规定的所有三个标准。总的来说，通过基因工程改善代谢表型比20世纪80年代最初设想的要困难得多。除GS方法外，迄今为止，其他减少乳酸和/或氨生产的代谢工程方法均未在工业中得到广泛采用。
常见的简单方法
最后，表1列出了四种减少乳酸和/或铵产量的简单和常见方法：（1）降低培养温度，（2）降低培养pH值，（3）用铜补充培养基，以及（4）选择具有乳酸消耗（LC）表型的克隆。尽管所有这些方法都是常用的，但没有一种方法被证明可以普遍减少乳酸和氨的产生。温度和pH值的变化通常会根据具体情况进行优化，并可能对细胞生长和/或产品质量产生负面或正面影响。尽管pH值的下降通常会减少乳酸的产生，但它也会导致谷氨酰胺消耗和铵产量的增加。补充铜是一种简单的方法，但不会减少所有相关细胞系的乳酸产量，也会对产品质量产生积极或消极的影响。选择具有乳酸消耗（LC）表型的克隆本质上是不普遍的，因为具有最佳特定生产力、产品质量或其他最大潜力的克隆可能会因缺乏LC表型而被丢弃。对于某些克隆，LC表型可能偶尔会因未知因素而丧失，即使在制造商业产品的经过验证的cGMP工艺中也是如此。这种表型变化相当常见，但文献中很少报道。尽管35年来一直采用多种方法来最大限度地提高细胞生长和生产力，同时最大限度地减少乳酸和/或铵的产生，如培养基和饲料的化学计量设计，但问题仍然存在。
乳酸补充和适应（LSA）技术
为了应对上述方法的局限性，进行了一项研究，以发明和开发一种新方法来减少工业动物细胞培养中乳酸和铵的产生。理想情况下，这将是一种简单、稳健的方法，可以在多个规模上轻松快速地使用，从用于细胞系筛选的小型多孔板培养物到用于商业制造的大型搅拌罐培养物。理想的情况下，它不会增加甚至可能降低培养的复杂性，也不需要额外的设备，例如新的反馈控制回路所需的设备。理想情况下，它将普遍适用于所有相关的细胞系和过程。本文介绍了这种新方法的初步可行性和概念验证研究。
