在过去的三十年里，生物制药已被证明是制药行业的主要增长因素。其中包括单克隆抗体在内的治疗性蛋白质是最大的群体，其次是治疗性肽和病毒。从生物制造业的早期开始，工艺开发部门就依靠实验室方法，利用小型设备开发稳健的制造工艺。
尽管毫无疑问是成功的，但这种方法存在生产率低和成本高的问题，并且随着对更快、更有效的方法的需求不断增加，为不断增加的候选药物开发稳健的工艺，必须寻求新的工艺开发方法（PD）。此外，设计质量（QbD）等监管举措需要更有效的工艺开发方法，以实现：（i）对工艺设计空间进行彻底和系统的表征；（ii）产品的关键质量属性（CQA）与工艺参数的联系，并最终；（iii）关键过程参数（CPP）和关键工艺参数（KPP）的定义。因此，通常基于单变量优化方法的试错过程开发策略已经过时，过程开发过程中使用的当前最先进的方法现在基于高通量筛选（HTS）技术和统计数据分析以及机械建模的组合。
与制备新的生物许可证申请相关的现代工艺开发需要测试数百种工艺条件（图1），因此，必要的吞吐量只能通过平行实验来实现，最好是用高度自动化的系统来实现。在过去的10年里，高通量工艺开发（HTPD）的重要性在整个行业得到了认可，描述高通量筛选（HTS）技术在生物工艺开发中的应用的出版物数量稳步增加，专门针对HTPD的同行评审期刊的特刊出版，以及完全致力于高通量工艺发展领域的系列会议的建立。下文简要总结了HTPD在上游和下游、分析挑战和可用解决方案方面的进展，以及与高通量实验引入的特定需求相关的数据分析。关于HTPD领域在生物药物开发中的应用的更详细的综述可以在其他地方找到。
高通量上游工艺开发
微生物发酵过程的标准开发方案涉及实验方法的设计，如果研究侧重于5到10个参数的影响，通常需要长达4周的时间才能完成。在哺乳动物细胞培养研究中，如果研究10天的过程，所需的时间会增加2到3倍。据报道，使用经典生物反应器开发典型的细胞培养过程需要3到4个月的时间。迄今为止，已经提出了几个系统，甚至已经商业化，旨在满足所需的吞吐量要求。这些包括：小型摇瓶、微量滴定板、旋转管和微流体。然而，开发此类系统最具挑战性的方面是，它们不仅应允许研究微生物和哺乳动物的表达系统，还应模拟通常在高密度生物质条件下运行的大规模操作。通常，需要在给定系统的吞吐量和适用性方面做出妥协，以测试工艺条件。
一般来说，对于生物工艺应用，24孔、48孔、96孔格式似乎是最常见的。它们可用于低VCD的批量筛选、克隆筛选和细胞培养基筛选。
另一方面，从HTPD的角度来看，微流体生物反应器原则上具有几个优点。它们基于5至700 mL的小工作体积，这使得单个生物反应器能够以相当小的模块形式并行组装，从而提供所需的实验吞吐量。据报道，使用这种系统成功优化了基于180种进料速率和pH值组合的抗体生产，在单克隆抗体产品和细胞存活率方面的性能相当于3L生物反应器。这种类型的系统的局限性是氧气转移速率低，这使得这些系统不适用于微生物工艺开发。通过引入蠕动式氧合混合器，微流体生物反应器的这些局限性得以规避，导致kLa值增加了50倍。
对于这种类型的生物反应器，pH和DO的监测通常是通过光学传感器完成的。有关小型化生物反应器系统氧转移特性的更详细讨论，读者应参考Kirk和Szita最近对这一主题的综述。与微流体生物反应器类似，通气也是与微量滴定板系统使用相关的重要属性。在这种形式中，气体转移仅通过表面曝气完成，可能不足以用于某些细胞培养，尽管通过使用挡板和方形孔以及通过使用氧载体可以实现显著改进。然而，值得一提的是，尽管存在这些挑战，但已有报道称，生物反应器已成功从96孔板扩大到10 L。
如上所述，讨论不同HTS平台时需要考虑的一个重要方面与给定平台提供的过程监控能力有关。如果系统应该为在最终过程规模上采用的控制策略提供可靠的答案，那么这一方面尤其令人感兴趣。一般来说，选择的平台/系统应提供高度的仪器，用于pH值和溶解氧的反馈控制。因此，微量滴定板通常只被视为一种筛查工具，其用途有限，无法为产品质量和数量分析提供数据，而带有内置pH和DO传感器的微流体装置将提供必要的控制水平。然而，后一种格式确实缺乏研究复杂的进料策略的能力，而这些策略对于达到如今成为制造标准的高细胞密度是必要的。另一方面，基于24个小型生物反应器的系统似乎具有作为良好开发平台所需的所有组件。此外，同一平台可成功用于研究系统对过程扰动的响应能力。
表1提供了上游作业HTPD调查中使用的不同模型系统的高级总结。对上游工艺开发中使用的高通量技术进行了更全面的概述，包括讨论了为满足上游工艺开发的高通量需求而提供的不同技术解决方案的优缺点。更多信息也可以在最近的一项研究中找到。
高通量下游工艺开发
与用于细胞培养开发的按比例缩小模型系统一样，必须仔细注意用于开发下游加工（纯化）步骤的按比例减小模型的设计和操作。特别重要的是，要确保所选的模型系统尽可能代表所考虑的下游装置在工艺规模上的运行。在这种特殊情况下，代表性并不意味着与大规模系统完全相同或是按比例缩小的模仿，而是意味着提供与正确描述大规模单元操作相关的数据。尽管为生物制品纯化中使用的所有可能的单元操作开发缩减模型存在挑战，但色谱的缩减可能是最具挑战性的。其原因不仅是色谱床中的分离发生在一系列小分离阶段中，而且色谱本身是一个多步骤的单元操作（例如，色谱循环中的结合-洗涤-洗脱阶段），需要仔细控制和优化许多工艺参数，以最大限度地提高产品回收率，并确保可靠和可重复地去除污染物和杂质。除了这些缩减问题外，与引入并行工作流相关的挑战也不应被忽视。
惠氏公司的工艺开发小组率先使用平行实验来开发色谱步骤，尽管更早就提出了使用平行技术来表征色谱步骤。在描述所谓的弱分配色谱的论文中，一种基于确定表观分配系数的方法是。从那时起，这种方法就被工业界用于不同类型的筛选研究，特别是在开发抛光色谱步骤时。
与上游工艺开发类似，用于开发色谱步骤的高通量技术不依赖于统一的格式或规模。目前使用三种格式，每种格式都有不同的尺寸。这些格式包括：微量滴定滤板、预包装移液管尖端和预包装迷你柱。所有这些格式都已成功应用于各种专注于色谱分离开发和优化的研究中，尽管不同的格式可能更适合特定类型的研究。
基于板和尖端的方法通常用于研究半平衡条件，通过观察吸附条件对所选目标函数（如结合容量和/或杂质去除）的影响。通常，这些实验侧重于静态结合的测定，但已经表明，微量滴定过滤板和填充有树脂的移液管尖端都可以用于生成结合数据的时间序列，这些数据与正确的机理模型一起可用于预测给定工艺条件下填充柱中的树脂性能，如停留时间、pH值和电导率。最近，提出了一种非常简单但优雅的数学处理方法，对微量滴定板或尖端格式生成的批吸收数据进行处理，以预测柱性能。
微型柱不仅可用于测定静态和动态容量，还可用于梯度洗脱研究、分辨率测定，原则上可用于使用标准色谱系统进行的任何类型的研究。
通过将实验室多通道液体处理器转换为多泵输送系统，并行操作其中几个（通常是八个）微型柱，实现了与微型柱相关的更高实验吞吐量，其中液体处理器的每个通道（针和注射器）代表一个将液体输送到微型柱之一的泵。每个柱的流出物流作为馏分收集在位于柱下方的微量滴定板上的一系列孔中，并按照预定的间隔前进。每个部分由几滴组成；然而，由于收集的液滴大小取决于许多因素，包括成分和流速，建议在每次运行结束时测量每个部分的最终体积。
当使用预充式移液管尖端时，通过在预定的时间段内从样品储器中连续抽吸和分配样品，使样品与色谱树脂接触。由于样品是通过压力驱动过程推动通过树脂颗粒床的，因此颗粒周围的对流条件可能类似于填充床中发生的情况，即使尖端和色谱柱中的填充模式不同。Wenger等人报道了该技术的一个非常成功的应用，他们使用移液管尖端开发了纯化病毒样颗粒的色谱步骤。
用于色谱分离高通量研究的第三种技术基于众所周知的分批吸附原理和微量滴定板格式提供的高通量优势的结合。成功应用该技术的例子包括，除其他外，通过阳离子交换或HIC色谱法对MAb纯化过程中的第二步进行研究，筛选纯化条件，表征多组分吸附系统，以及估算动态结合能力。这些盘子可以在家里准备，也可以购买预先填充的。在前一种情况下，应预期开发一种可靠的填充板材的方法，这需要大量的工作，而在后一种情况中，板材格式中可用树脂的选择可能会受到限制。这些研究包括吸附等温线测定、动态结合能力估算、特异性洗脱和CIP处理的有效性等。这种格式的一个非常吸引人的特点是，使用多通道移液器、真空歧管等现成设备，可以很容易地手动执行典型的实验工作流程。
已经发表了三种HTPD格式的理论比较，并就其在各种色谱步骤开发中的适用性提出了建议。尽管所有格式均可用于工艺开发，但在操作迷你型时，需要考虑与不同流体动力学流态相关的人为因素。尽管所有格式都可用于体积小于或等于200 mL的柱。这些尺度下的线速度分布与大规模柱操作相关的速度分布不可比。最近，通过引入工作体积为600毫升、床层高度分别更大的微型柱，避免了这种负面影响。较长的床高度允许在代表更大规模色谱操作的线速度下达到相关的停留时间。
公司在流程开发的不同阶段应用不同的格式并不罕见。在这种情况下，在开发过程的早期使用微量滴定板和移液管尖端，此时树脂和条件的筛选覆盖了更大的实验空间，而当在大大减少的设计空间内评估所选树脂时，使用微型柱或实验室柱进行最终表征/优化。最近发表了描述这种方法的例子。
表2列出了与高通量工艺开发理念兼容的研究示例。其中，基于平板的研究用于研究色谱树脂的病毒清除性能，优化蛋白a亲和柱的清洁方案，通过研究批次间差异的影响来评估色谱步骤的稳健性，以及应用HTPD方法来支持QbD范式代表了HTPD领域正在发展的方向。
尽管色谱法已被证明是下游加工的主力，但在某些情况下，对替代技术的研究是合理的。从纯化或初级回收的角度来看，这些技术可能是有益的。此类技术的例子包括沉淀、双水相分配和结晶。考虑到这些技术属于本体分离组，描述使用高温超导方法对这些技术进行表征和/或优化的报告并不令人惊讶。由于其开创性，很少有值得一提的例子包括：基于双水相萃取步骤的全自动开发；应用遗传算法开发HTS筛选方法；开发各种类型的沉淀步骤；蛋白质折叠步骤的开发；使用HTS方法优化聚乙二醇化反应以及开发基于吸附膜的纯化步骤。
高通量研究中使用的分析
高吞吐量工作流也可能引入与自动化、分析和数据评估相关的新瓶颈。通常，在将高吞吐量工作流引入流程开发时，需要付出的代价是对高效分析的需求增加。尽管通过应用实验设计可以显著减少测试的实验条件数量，但分析的负担仍然相当高。此外，分析还对上游运营的HTPD中使用的系统类型施加了一些限制。由于实验时间较长，提取用于分析的样本数量可能很大，可能需要考虑生物反应器体积的变化及其对培养性能的影响。
此外，即使在运行期间采集的样本数量不多，小样本量也会限制纯化产品用于后续质量属性分析的可用性。关键和关键工艺参数的识别在很大程度上取决于分析测试的结果。在工艺开发过程中，这些测试的结果用于确定如何控制工艺，以确保满足关键质量属性。以与单克隆抗体工艺开发相关的开发活动为例，需要使用以下方法：尺寸排阻色谱、反相色谱、离子交换色谱、等电聚焦、SDS-PAGE还原和非还原、碳水化合物含量来确定单克隆抗体纯度，包括产品相关杂质。此外，还需要考虑用于测量过程相关杂质（如蛋白A、宿主细胞蛋白质（HCP）、宿主细胞DNA）的方法。
尽管其中一些技术已成功转化为HTS格式，包括HCP、残留蛋白A和疫苗过程中的多糖定量，但要充分实现高通量过程开发概念的潜力，仍需要开发适当的高通量分析技术。这种开发可以侧重于样本复用方法或当前方法的优化。后一种方法的例子包括聚集体的定量，这通常基于相对较慢的表征方法，如尺寸排阻色谱法，多年来一直被认为是HTPD研究的真正瓶颈，现在可以用于HTPD需求，并取得相当好的结果。最近提出了另一个类似哲学的例子，即使用现有的分析技术，但在需要进行多次分析时，通过战略性部署分析方法来减轻与HTPD相关的分析负担。
总结
高通量方法对流程开发效率和整体流程知识的影响已经很大，并且将变得越来越重要。可以肯定的是，随着支持高通量分析和工艺开发技术的技术和自动化的成熟，用于高通量工艺开发的系统将在未来几年继续发展。
此外，假设不实施HTPD理念，就不可能将设计质量范式应用于流程开发，这可能是正确的。QbD研究中需要在短时间内实现的过程理解和优化水平，实际上只能通过使用高通量方法来开发和优化不同的单元操作来实现。
最后，对HTPD活动期间生成的大量数据进行评估和分析，并为这些数据拟合适当的模型，是一项复杂的任务。尽管使用统计建模仍然是最常见的方法，但已经讨论了基于机械建模的更复杂的数据评估策略，包括分子特性和启发式数据。
总之，虽然HTPD可以被视为一个成熟的领域，但要充分认识到高通量技术在工艺开发领域的潜力，还需要进一步改进。这些包括：更快、更灵敏的高通量分析技术，与净化列车上游工艺开发集成自动取样的高通量上游系统，以及标准化的数据分析平台，包括用于扩大规模预测和工艺优化的软件包。
