右美托咪定对丙泊酚诱导的发育期大鼠远期学习记忆障碍的影响及机制研究

1贵州医科大学麻醉学院，贵阳 550004；2重庆市大足区中医院麻醉科，重庆 402360；3贵州医科大学附属医院麻醉科，贵阳 550004

【论著】

本研究建立认知障碍模型，探讨右美托咪定（Dex）对丙泊酚诱导的发育期大鼠学习记忆障碍的影响，并探索其潜在的分子机制。

1.1　分组与处理

7日龄新生SD大鼠120只，随机分为6组（每组20只）：对照组（Con组）、丙泊酚组（Pro组）、Dex组、Dex预给药组（DP组）、蛋白激酶A（PKA）特异性拮抗剂（H89）+DP组（HDP组）、二甲基亚砜（DMSO）+DP组（CDP组）。Pro组大鼠按参考文献介绍的方法建立模型：腹腔注射丙泊酚50 mg/kg，待大鼠翻正反射恢复后（40~60 min）追加丙泊酚50 mg/kg，麻醉苏醒后2 h取10只大鼠海马组织检测乳酸脱氢酶（LDH）浓度及磷酸化PKA（p‑PKA）、核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3（NLRP3）、胱天蛋白酶‑1（caspase‑1）及gasdermin‑D（GSDMD）蛋白水平，较Con组明显升高则表示Pro组造模成功。Con组腹腔注射等量生理盐水；Dex组腹腔注射Dex25 μg/kg；DP组腹腔注射Dex 25 μg/kg，20 min后按照Pro组给药；HDP组腹腔注射H89 0.05 mg/kg，1 h后同DP组；CDP组腹腔注射等量DMSO，1 h后同DP组。随后将处理完毕的大鼠放入持续低流量给氧（2 L/min）的恒温培养箱中，观察呼吸频率和皮肤颜色以监测呼吸暂停和缺氧情况。将婴儿体表氧饱和度探头固定于大鼠腹部监测防止缺氧发生，维持脉搏血氧饱和度在95%~99%，麻醉期间，每隔20 min监测1次脉搏血氧饱和度，直至翻正反射恢复。大鼠麻醉苏醒后，继续同窝饲养至30日龄。

1.2　Morris水迷宫实验

大鼠饲养至30日龄时，采用Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力。Morris水迷宫实验包含定位航行实验和空间探索实验，共5 d。实验在一个直径150 cm、高50 cm的圆形、平底黑色水池中进行。水池分为4个象限，注满23 ℃~25 ℃的水，内部无明显标记。在任意区域放置直径9 cm的圆形平台，平台顶部低于水面1 cm，并保持平台位置不变。① 定位航行实验：从第1天起每天分别从4个象限等距离中点上方将大鼠面向池壁放入，令其在池内自由游泳60 s寻找水下平台，记录找到平台所需时间（逃避潜伏期），若60 s内未找到平台，则逃避潜伏期记为60 s，并将其引导至平台上，连续进行4 d。② 空间探索实验：第5天撤除平台，大鼠自由游泳1 min，记录穿越平台次数。Morris水迷宫实验结束后，使用颈椎脱臼法处死大鼠，于冰上取出海马组织，每组5只大鼠海马组织用于检测LDH活性，剩余每组5只大鼠海马组织−80 ℃保存。

1.3　LDH活性检测

使用LDH试剂盒测定LDH浓度。取海马组织，匀浆后3 000 r/min离心10 min，取上清液。采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。将上清液转移到新的96孔板，与LDH工作试剂孵育30 min。酶标仪波长450 nm测定各孔光密度值。LDH浓度按照说明书计算公式计算。

1.4　免疫印迹法检测海马组织p‑PKA、NLRP3、caspase‑1及GSDMD蛋白水平

取各组海马组织，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂充分裂解细胞，冰上研磨。于4 ℃下离心组织匀浆，12 000 r/min离心。取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。6组分别取20 μg蛋白液进行十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜并封闭，与p‑PKA蛋白抗体（Ser291）、NLRP3抗体、caspase‑1抗体、GSDMD抗体4 ℃孵育过夜，缓冲溶液（TBST）洗去一抗后加二抗室温孵育，再用TBST清洗3遍，每次5 min。使用电化学发光剂显影图像，并在凝胶成像系统图像分析系统中分析条带。以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值反映目的蛋白水平。

2.1　逃避潜伏期及穿越平台次数

6组大鼠第1天逃避潜伏期差异无统计学意义（均P>0.05）。与Con组比较，Pro组、DP组、HDP组及CDP组第2~4天逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少（均P<0.05）；Dex组逃避潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义（均P>0.05）。与Pro组比较，Dex组、DP组和CDP组第2~4天逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增多（均P<0.05）；HDP组逃避潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义（均P>0.05）。与DP组、CDP组比较，HDP组2~4天逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少（均P<0.05）。见表1、图1。

2.2　p‑PKA、NLRP3、caspase‑1及GSDMD蛋白水平

与Con组比较，Pro组、DP组、HDP组、CDP组海马组织p‑PKA蛋白水平降低，NLRP3、caspase‑1和GSDMD蛋白水平明显升高（均P<0.05）；Dex组海马组织p‑PKA、NLRP3、caspase‑1和GSDMD蛋白水平差异无统计学意义（均P>0.05）。与Pro组比较，Dex组、DP组和CDP组海马组织p‑PKA蛋白水平升高，NLRP3、caspase‑1和GSDMD蛋白水平明显降低（均P<0.05）；HDP组海马组织p‑PKA、NLRP3、caspase‑1和GSDMD蛋白水平差异无统计学意义（均P>0.05）。与DP组、CDP组比较，HDP组海马组织p‑PKA蛋白水平降低，NLRP3、caspase‑1和GSDMD蛋白水平明显升高（均P<0.05）。见图2。

2.3　LDH浓度

与Con组比较，Pro组、DP组、HDP组及CDP组海马组织LDH浓度明显升高（均P<0.05）；Dex组海马组织LDH浓度差异无统计学意义（P>0.05）。与Pro组比较，Dex组、DP组和CDP组海马组织LDH浓度明显降低（均P<0.05）；HDP组海马组织LDH浓度差异无统计学意义（P>0.05）。与DP组、CDP组比较，HDP组海马组织LDH浓度明显升高（均P<0.05）。见表2。

本研究采用100 mg/kg丙泊酚腹腔注射建立认知障碍模型。腹腔注射丙泊酚后p‑PKA蛋白水平降低，NLRP3、caspase‑1及GSDMD蛋白水平升高；而Dex预给药后p‑PKA蛋白水平升高，NLRP3、caspase‑1及GSDMD蛋白水平降低，这表明Dex能够通过激活PKA，调控NLRP3/caspase‑1信号通路，改善丙泊酚诱导的海马组织细胞焦亡。LDH在正常情况下很难通过细胞膜，只有当细胞膜受损时，LDH才会释放出来，可用于检测细胞膜是否受损。Pro组和HDP组LDH浓度明显增高，而Dex预给药后明显降低，表明细胞膜受损程度明显改善。此外，为了检测大鼠是否存在远期学习记忆障碍，本研究进行了Morris水迷宫行为学实验，结果表明，与Con组、Dex组比较，Pro组大鼠逃避潜伏期明显延长，而Dex预给药后能够改善丙泊酚引起的学习记忆障碍。以上结果均提示Dex能够减轻丙泊酚诱导的发育期大鼠海马组织细胞焦亡，改善其学习记忆能力。

对于Dex是否产生神经毒性，本研究显示，Dex组与Con组蛋白水平以及LDH浓度差异均无统计学意义，Dex不会损害幼年大鼠海马而产生学习记忆障碍。本研究为了验证Dex能否激活PKA，使用PKA特异性拮抗剂H89，发现无论从免疫印迹法蛋白水平还是从LDH浓度变化以及行为学表现来看，HDP组与Pro组结果相似，说明使用拮抗剂后Dex的神经保护作用消失，这表明Dex能够激活PKA，使NLRP3/caspase‑1信号通路失活，对丙泊酚诱导的发育期大鼠大脑损伤产生保护作用。此外，HDP组与CDP组比较可以发现，HDP组的Dex保护作用消失，CDP组保留了Dex保护作用，说明H89对海马组织产生了作用。

Dex在临床上是以持续静脉输注方式给药，本研究采用腹腔注射；本研究也未对Dex调控A型激酶锚定蛋白调控PKA活性从而抑制NLRP3/caspase‑1信号通路进行研究，这是本研究的不足，也是下一步的研究方向。但这是一项临床前研究，为Dex作为减轻丙泊酚诱导发育期毒性的候选药物奠定了基础。

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