1.Bowtie2软件的适用范围和应用场景
2.Bowtie2软件的下载与安装
方法一：使用源码安装
# 下载安装包
wget https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/2.5.4/bowtie2-2.5.4-sra-linux-x86_64.zip/download
# 解压安装包
unzip bowtie2-2.5.4-sra-linux-x86_64.zip
# 跳转到解压后目录，并获取其路径
cd bowtie2-2.5.4-sra-linux-x86_64 && pwd
# 将前一步获取的路径追加到 ~/.bashrc 文件的末尾（使用此步骤前建议备份~/.bashrc）
echo PATH=$PATH:/path/to/software/bowtie/bowtie2-2.5.4-sra-linux-x86_64 >> ~/.bashrc
# 重新加载 ~/.bashrc 文件
source ~/.bashrc
# 验证文件是否正确添加（若输出的是 bowtie2 的路径，则表示设置成功）
which bowtie2
3.Bowtie2软件的参数解读和使用建议
3.1 参数解读
# 查看帮助信息
bowtie2 -h
# 参数说明
# 常用参数：
-x 由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀，需要指定路径及其共用文件名
-1 质控后与read2配对（paired）的read1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和 -2中指定的文件一一对应
-2 质控后与read1配对的read2
-U 质控后未配对（unpaired）的reads
-S 所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出
-p 线程数
# 可选输入参数
-q 输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值
-f 输入的文件为FASTA格式文件
-5/--trim5 剪掉5'端长度的碱基，再用于比对(default: 0)
-3/--trim3 剪掉3'端长度的碱基，再用于比对(default: 0)
--phred33 输入的碱基质量等于ASCII+33
# 可选Paired-end参数
--no-mixed 默认设置下, 一对reads不能成对比对到参考序列上, 则单独对每个read进行比对. 该选项则阻止此行为
--no-discordant 默认设置下, 一对reads不能合理比对（concordant alignment,即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件）到参考序列上, 则搜寻其不合理比对（disconcordant alignment, 即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上, 但是不满足-I,-X,--fr/--rf/--ff的条件）。该选项阻止此行为
# 可选–end-to-end模式下的预设参数
--end-to-end 比对是将整个read和参考序列进行比对，该模式--ma的值为0，该模式为默认模式，--local模式冲突
--local 在这种模式下，Bowtie 2不要求整个读取从一端到另一端对齐。相反，为了达到最大可能的对齐分数，可以从末端省略一些字符（“软裁剪”）
--very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
--fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
--sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default in --end-to-end mode)
--very-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
# 可选报告参数
-k 默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果, 并报告其中最好的比对结果（如果好几个最好的比对结果得分一致, 则随机挑选出其中一个），该模式下, bowtie2最多搜索出一个read个比对结果, 并将这些结果按得分降序报告出来
-a 和-k参数一样, 不过不限制搜索的结果数目. 并将所有的比对结果都按降序报告出来. 此参数和-k参数冲突. 值得注意的是: 如果基因组含有很多重复序列时, 该参数会导致程序运行极其缓慢
# 可选Sam文件使用的参数
--no-unal 不记录没比对上的reads
--no-hd 不记录SAM header lines（以@开头）
--no-sq 不记录@SQ的SAM header lines
--rg-id 设定read group Id到
--rg增加作为一行@RG
# 可选输出参数
--un 将未对其序列写入到指定路径
--no-unal不能map到GENOME的reads,不保留sam记录
--un-conc 不能map到GENOME的reads，fasta格式
--un-conc-gz 能map到GENOME的reads，fasta格式, gzip压缩
--al-conc 能map到GENOME的reads，fasta格式
--al-conc-gz 能map到GENOME的reads，fasta格式, gzip压缩
3.2 bowtie2使用方法
# 查看参考序列（此处以bowtie2自带示例数据为例）
head lambda_virus.fa
# 使用参考序列构建索引，index为索引前缀
bowtie2-build lambda_virus.fa index
# 目标序列与参考数据库进行比对
# 对双端序列比对
bowtie2 -x index -1 reads_1.fq -2 reads_2.fq -p 32 -S example_pair.sam
# 对单端序列比对
bowtie2 -x index -U reads_1.fq -p 32 -S example_single.sam
# 使用samtools将sam文件转换为bam文件以供后续分析使用
# 需提前安装和配置samtools
samtools sort example_pair.sam > example_pair.bam
samtools sort example_single.sam > example_single.bam
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