胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI），是指通过显微操作技术将单个精子注入卵母细胞胞浆内，从而使卵母细胞受精的一种辅助生殖技术。与传统的体外受精相比，ICSI对精子活力、数量及受精能力的要求较低，在临床上是第 2 代“试管婴儿”的关键技术。在科研领域，ICSI 可结合其他生物工程技术，制备基因编辑动物模型。此外 ICSI 也是精子冷冻复苏构建受精胚胎的重要辅助手段。本文详细描述了猴胞浆内单精子注射的操作方法及流程。
关键词：精子 卵母细胞 受精 辅助生殖
1. 3.5 cm 培养皿（CORNING，catalog number: 430165）2. 3.5 cm 操作皿（FALCON，catalog number: 353001）3. Borosilicate Glass（B100-75-10）4. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）5. 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）7. 15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）9. PVP（Sigma，catalog number：PVP360）14. NaCl（Sigma-Aldrich，catalog number：S7653）15. KCl（Sigma-Aldrich，catalog number：P5405）16. CaCl2·2H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：C7902）17. MgCl2·6H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：M2670）18. NaH2PO4（Sigma-Aldrich，catalog number：S8282）19. NaHCO3（Sigma-Aldrich，catalog number：S5761）20. HEPES（Sigma-Aldrich，catalog number：H3375）21. D-Glucose（Sigma-Aldrich，catalog number：G7528）22. Sodium Pyruvate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5280）23. Sodium lactate (60% syrup)（Sigma-Aldrich，catalog number：L4263）24. BSA（absin，catalog number：abs9156）25. penicillin-streptomycin (100X)（gibco，catalog number：15070-063）26. PVA（Sigma-Aldrich，catalog number：P8136）27. HCl（沪试，catalog number：7647-01-0）28. Taurine（Sigma-Aldrich，catalog number：T8691）29. Asparagine（Sigma-Aldrich，catalog number：A4159）30. Cysteine（Sigma-Aldrich，catalog number：C7352）31. Histidine（Sigma-Aldrich，catalog number：H6034）32. Lysine（Sigma-Aldrich，catalog number：L5501）33. Proline（Sigma-Aldrich，catalog number：L5607）34. Serine（Sigma-Aldrich，catalog number：S4311）35. Aspartic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：A8949）36. Glycine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8790）37. Glutamic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：G8415）38. Glutamine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8540）39. Pantothenate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5155）40. Phenol Red（Sigma-Aldrich，catalog number：P0290）1. 培养箱（Thermo Scientific，model：Forma 3111、Forma 371）2. 拉针仪（Sutter Instrument，model：P97）3. 断针仪（Narishige，model：MF-900）4. 倒置显微镜（Olympus，model：IX-73）5. 体视显微镜（Olympus，model：SZX7）7. 微量注射器（Narishige IM-9B）8. 离心机（Eppendorf centrifuge，model：5702）实验流程
1. 超排母猴及获取卵母细胞；
2. 猴子精子的采集与获能处理；
3. 完成注射，将卵子移入培养碟中放置培养箱培养；
4. 做好详细记录。
单精注射步骤
一、精子获能处理
1. 将采集的精子液化15-20 min，取液化好的精子上清加入到15 ml离心管内；
2. 在精子离心管内加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
3. 离心完后去上清，再加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
4. 离心完后去上清，再加入4 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
5. 离心完后去上清，再加入2 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
6. 离心完后等待精子上游，上游3分钟；
7. 上游后取中层的精子，在培养皿内制备精子滴，盖上矿物油，放入培养箱待用。
二、单精子显微注射
1. 将TH3显微注射操作皿做好预热：取200 μl TH3液，在显微操作碟内制备4-5滴TH3液滴和一个柱状TH3液滴，再做一个10% PVP的液滴，每滴体积15-20 μl，并覆盖矿物油；
2. 将HECM9aa培养皿做好预热：取200 μl HECM9aa培养液，在培养皿内制备10-13个液滴，每滴体积约15-20 μl，并覆盖矿物油。
3. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为100-110 μm和内径为15-20 μm，打弯成20-30度的持卵针；
4. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为7-8 μm和内径为5-6 μm，打弯成20-30度的精子注射针；
5. 用1 ml注射器从注射针的末端装入1-2 mm水银待用；
6. 将制备的显微注射皿放置于载物台上，从低倍视野开始观察整个显微操作滴；
7. 将持卵针安装于操作仪左侧的IM9B，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平；
8. 将注射针安装于操作仪右侧的piezo压电冲击驱动系统的微注射器上，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平，保持与持卵针在同一水平线；
9. 用胚胎转移管将一组MII期卵母细胞转移到操作皿TH3液滴中，同时将处理的3-5 μl获能精子加到另一个TH3液滴内；
10. 镜下在10% PVP内清洗注射针并调整注射针到精子滴中，用注射针尖轻击精子尾部来制动精子后，将精子尾先头后吸入注射针内，移动注射针到放置卵母细胞的注射滴中（当注射针内的精子用完后，重复此步骤）；
11. 用持卵针抓取并固定MII期卵母细胞，并调整第一极体在六点或十二点的方向，注射针利用脉冲震荡刺穿破透明带，将精子推到注射针口后通过脉冲震荡辅助注射入卵母细胞内，以尽量少的液体吐出精子；（见图1、图2）
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图1. 极体在约 6 点方向，脉冲震荡刺穿破透明带
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图2. 精子推到注射针口，准备进行注射
12. 完成注射后，持卵针放开卵母细胞；
13. 重复上述操作直至完成所有的MII期卵母细胞的精子注射，将胚胎转移到HECM9aa培养液中在 37 °C，5% CO2培养箱中培养；
14. 培养箱中培养六个小时以上，在显微镜下检查原核形成情况，出现两个原核的胚胎视为正常受精。（见图3）
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图3. 受精卵，箭头所指处为两原核位置
注：本文以7只供体数，共获取103枚卵母细胞进行ICSI，其中有91枚正常受精，受精率达88%。（见表1）
1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表2）表2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3)（表3）
表3. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3) 配制表
3. HECM-9（表4）
王燕, 许玉婷, 李春杨, 孙强. (2023). 猴胞浆内单精子注射. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010985. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010985.
