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⊙编辑：一墨
中医传承平台软件得到了北京、上海、贵州、山东、天津等院士、国医大师、名老中医工作室的广泛应用，获得高度认可，被认为是名老中医学术思想和临床经验传承的重要工具。全国100余家单位应用本软件进行医案整理、方剂组方规律分析等，已发表学术论文2000余篇，应用该软件进行名老中医经验总结的毕业研究生超过1000名，成为名医经验传承、中医药文献分析、中药产品研发的有力工具。
本文基于中医传承计算平台及生物信息学分析《赤水玄珠》中辨治痹证的遣方用药特点及内在机制，为临床以痹证为代表的风湿免疫疾病的中医诊治提供参考。本研究筛选《赤水玄珠》中辨治痹证的临证医案，提取出相关方剂，数据标准化处理后录入中医传承计算平台分析药物频次、组方规律等，获得核心药物组合。对核心药物组合进行靶点挖掘、蛋白质相互作用(PPI)分析、基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，探讨核心药物组合治疗痹证的作用机制。
结果显示：（1）综合药物频次、组方规律及聚类分析确定黄芪、当归、白芍、人参、防风为治疗痹证的核心药物组合｡（2）治疗痹证的药物活性成分包括儿茶素、异欧前胡素、β-谷甾醇、豆甾醇和山柰酚等，蛋白质相互作用网络模型显示，度值较高的靶点基因包括IL-1β、PPARG、AKT1、IL-6以及TNF等。（3）生物信息学分析结果显示涉及Toll样受体信号通路、白介素-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等通路。以上研究结果表明，孙氏辨治痹证的核心药物组合，通过多成分、多靶点以及多通路发挥抗炎、调节免疫、抗氧化损伤和改善骨破坏等作用。本研究为中医传承计算平台与网络药理学联合应用，宏观与微观结合，可为核心方药挖掘与机制研究提供借鉴，若能结合实验验证，则更具有说服力。
彭记棚，袁雪梅，宋云云，黄春霞，李丹，马武开，姚血明类风湿关节炎（rheumatoid
arthritis，RA）是一种伴有关节肿胀甚至关节变形的慢性全身性自身免疫性疾病，其主要特征为对称性多关节炎，可引起关节的进行性损伤，疾病后期甚至会导致关节功能丧失，严重影响患者的生活质量。目前RA的治疗药物种类繁多，主要包括非甾体抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）、改善病情抗风湿药（disease－modifyinganti－rheumaticdrugs，DMARDs）、糖皮质激素和生物制剂等，但因其需要长期用药且疗效有限，不良反应明显，导致多数患者无法坚持用药。因此，寻找新型药物控制RA病情进展，改善患者生活质量是研究者需要解决的问题之一。目前，中医药对RA的疗效得到业内广泛认可，利用中医药的优势，寻找和开发高效低价且不良反应小的药物具有重要意义。根据RA的临床表现，可将其归属于中医“痹证”范畴，中医学认为本病病因多为正气不足，感受风、寒、湿之邪所致。正如《素问·痹论》云：“所谓痹者，各以其时，重感于风寒湿之气也”。《中藏经》言：“痹者，闭也。五脏六腑感于邪气，乱于真气，闭而不仁，故曰痹”。痹证是困扰人类健康的重要疾病之一，中医药治疗痹证具有一定的优势。孙一奎（1522—1619年），字文垣，号东宿，是我国明代著名医家，其所著《赤水玄珠》内容丰富，囊括内外妇儿各科病症，是一部极具参考价值的综合性医书，其中对于痹证的论治独具特色。故本研究筛选《赤水玄珠》中辨治痹证的临证医案，提取出相关方剂81个，涉及中药127味，通过运用现代数据挖掘技术和生物信息学方法，对孙氏辨治痹证的遣方用药特点及规律进行深入分析，挖掘核心药组，探索其主要干预靶点与通路，并详细阐述其现代生物药理学机理，以期为RA的中医用药方案提供理论参考。
筛选《赤水玄珠》中符合研究标准的临证医案，提取出相关方剂，并通过查阅相关文献、古籍等完善方药信息，经专家认证后将处方中的药物录入Excel表格，数据标准化处理后录入中医传承计算平台。（1）据医案资料可明确涉及病种属痹证；（2）方药信息完整。（1）医案资料尚不明确所涉病种为痹证；（2）方药信息不完整。根据《中华人民共和国药典（2020年版）》和《中医大辞典》，对处方中的药品名称进行规范化和标准化处理，如：生甘草、炙甘草、甘草梢规范统一为甘草，新豆豉、豆豉规范统一为淡豆豉，归尾、当归身规范统一为当归等。采用双人核对法将数据录入中医传承计算平台（V3.0）软件系统，构建处方数据库，对中药的频次、性味归经以及组方规律等方面进行深入分析。运用熵聚类技术，对中药的频次、性味归经以及组方规律进行综合分析，从而提炼出孙氏治疗痹证核心用药组合。将核心药组的中药依次录入中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://old.tcmsp－e.com/tcmsp.php），依次检索核心药物组合查询有效成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似度（drug－likeness，DL）≥0.18进行筛选并总结归类，获取核心药物组合活性成分，基于活性成分得到对应靶点蛋白，删除重复项。再利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org）获取人源（Homo sapiens）的全部蛋白质基因信息，再将药物活性成分对应的靶点基因名称和Uniprot得到的靶点基因信息相匹配，剔除不匹配的靶点蛋白基因，进一步删除重复项，得到标准化名称的靶点基因。1.4 疾病靶点和“核心药物组合－疾病”共有靶点采集以“rheumatoid arthritis”为关键词，在DisGenet数据库（https://www.disgenet.org/）中检索RA疾病的靶点基因信息，通过筛选整理后获得RA的靶点基因。使用Venn2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny2.1/）在线网络绘图工具绘制“核心药物组合－RA”共有靶点的韦恩图，并通过Cytoscape3.9.1软件绘制“药物－有效成分－共有靶点”图。将“核心药物组合－RA”共有靶点导入STRING数据库（https://string－db.org/）构建蛋白质间的相互作用（protein－proteininteraction，PPI）网络模型图。勾选“MutipleProtein”，将获得的共同交集靶点基因输入，种属选择人类即“Homo sapiens”，其他相关参数均保持默认设置，获得PPI网络数据。将结果以TSV格式导出，利用Cytoscape3.9.1软件进行拓扑分析，根据度（degree）值筛选出关键作用靶点蛋白。将核心药物组合活性成分与RA疾病的交集靶点蛋白上传至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据分析平台，设定阈值为P＜0.05，标识符为“OFFICIAL＿GENE＿SYMBOL”，选择物种为“Homo sapiens”，提交列表进行GO功能及KEGG信号转导途径富集分析，导出结果并整理上传至数据富集分析平台（https://hiplot－academic.com/basic）得到富集结果，并绘制相应的富集分析图。
筛选出《赤水玄珠》中孙氏辨治痹证方剂81个，涉及中药127味。按频次降序编排，使用频率最高的前五位中药是甘草、当归、白芍、川芎和苍术，使用频率≥10次的中药共有21味，见表1。![]()
使用“统计分析”模块下的“四气统计”“五味统计”“归经统计”对127味中药进行统计分析，四气统计结果显示温性出现频次最多（365次，占比50.49%），五味统计结果显示苦味频次最多（379次，占比33.04%），归经统计结果显示脾经频次最多（429次，占比21.22%），见表2、表3、表4。![]()
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通过“方剂分析”模块下的“关联规则”分析用药模式，设置支持度个数为8，置信度为0.9，共获得置信度＞0.9的关联规则12条，按置信度降序编排，“白芍、陈皮→甘草”“白芍、黄芪→甘草”和“甘草、柴胡→升麻”等置信度达100%，“麻黄→甘草”置信度为92%，“当归、羌活→甘草”置信度为91%，具体情况见表5。设置支持度个数为16，置信度均为0.9，得到药物关联规则组合网络图，见图1。![]()
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共挖掘出核心药物组合89组，筛选出使用频次≥15的核心药物组合10组，见表6。同时，演化出孙氏辨治痹证的潜在新方5个，见表7。依据软件新组方发掘系统，通过“方剂分析”模块的“聚类分析”，得到方剂聚类分析图（kmeans算法＋回归模拟），见图2，可见分组1药物数据相对集中，且“甘草、当归”“甘草、白芍”“甘草、防风”药物组合使用频次排名靠前，遂将新方组合“甘草、黄芪、当归、白芍、人参、防风”拟定为孙氏治疗痹证的核心处方，由于甘草属于调和作用，虽然使用频率高，但并非用于治疗痹证，故将甘草剔除，将“黄芪、当归、白芍、人参、防风”进行生物学分析。![]()
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利用TCMSP数据库进行筛选，获得核心药物活性成分124个，筛选出8个代表性活性成分，包括芍药苷元、7－O－甲基异微凸剑叶莎醇、高丽槐素、儿茶素、异欧前胡素、豆甾醇、山柰酚、β－谷甾醇，见表8。经去重的活性成分对应靶点112个、RA疾病相关靶点2724个，取交集获取“核心药物组合－疾病”64个交集靶点，见图3。通过Cytoscape3.9.1软件绘制“药物－有效成分－共有靶点”图，其中橙色节点表示药物，绿色节点表示药物活性成分，蓝色节点表示药物与疾病的交集靶点，见图4。![]()
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将所获得的64个“药物－疾病”交集靶点上传至STRING数据库，通过Cytoscape3.9.1软件构建蛋白质相互作用网络模型，并筛选出关键靶点11个，包括白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、过氧化物酶体增殖激活受体－γ（peroxisome proliferator activated receptor
gamma，PPARG）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT Serine/Threonine Kinase1，AKT1）、白介素－6（interleukin－6）以及肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）等，具体情况见图5。这些关键靶点可能是核心药物组合治疗RA的核心基因。![]()
将64个“药物－疾病”交集靶点基因导入DAVID数据平台，设定阈值P＜0.05，进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析由生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular
function，MF）组成，结果显示GO富集分析得到生物过程（BP）401条，包括细胞凋亡（apoptotic process）、凋亡过程正调控（positive regulation of apoptotic process）、基因表达的正调控（positive regulation of gene
expression）等；细胞组分（CC）53条，包含大分子复合物（macromolecular complex）、膜筏（membrane raft）、质膜（plasma membrane）等；分子功能（MF）79条，包括酶结合（enzyme binding）、相同蛋白质结合（identical protein binding）、蛋白质同源二聚化活性（protein homodimerization
activity）等。将富集分析结果可视化，见图6。KEGG富集结果显示共获取137个通路，其中Toll样受体信号通路（Toll－like receptor signaling pathway）、白介素－17信号通路（IL－17 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等为主要富集通路，选取排前20位的富集结果构建气泡图，见图7。上述结果提示核心药物组合黄芪、当归、白芍、人参、防风可能通过以上生物进程和信号通路治疗RA。
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本研究通过中医传承计算平台挖掘《赤水玄珠》辨治痹证的方药。在中药性味归经方面，四气统计结果显示温性出现频次最多（365次，占比50.49%），这与中医学“寒者温之，热者寒之”理论相符。从五味统计结果来看，苦味频次最多（379次，占比33.04%），苦能泄、能坚、能燥，苦味药对于外感风寒湿证的治疗效果较好。归经统计结果显示脾经频次最多（429次，占比21.22%），五脏均有涉及，用药多注重脾的固护，脾在体合肉，主四肢，即脾具有运化水谷精微，充养肌肉和四肢的功能，若脾失健运，水谷精微亏乏，四肢肌肉失养，则表现为肌肉消瘦、四肢软弱无力，甚至萎废不用。脾主运化水湿，无论内湿还是外湿，都与脾密切相关，若运化水湿功能失调，会导致湿邪留滞人体，从而发为痹证。此外，脾虚可导致营卫不足，外邪易侵关节肌肉，或脾失健运，生成湿邪痰瘀，结聚关节，从而导致痹证的发生，脾虚是痹证发生、发展的关键，贯穿于痹证病程始终。现代医家多从脾入手治疗痹证，取得较好的临床治疗效果。通过软件核心药物组合聚类以及新组方发掘系统，演化出孙氏辨治痹证的潜在新方5个，包括“甘草、黄芪、当归、白芍、人参、防风”等5个组合，该组合中防风、当归祛风活血止痛，黄芪、人参补气，白芍、甘草调经止痛，由于甘草属于调和作用，虽然使用频率高，但并非用于治疗痹证，故将甘草剔除，遂于新方组合“黄芪、当归、白芍、人参、防风”拟定为孙氏辨治痹证的核心药物组合，全方共奏益气通经、祛风止痛之效，与痹证风、寒、湿致经络、气血不通的病机特点一致。对该核心药物组合进行生物信息学分析，通过TCMSP数据库筛选得到核心药物活性成分共124个，筛选出8个代表性活性成分，包括芍药苷元、7－O－甲基异微凸剑叶莎醇、高丽槐素、儿茶素、异欧前胡素、豆甾醇、山柰酚、β－谷甾醇，其中儿茶素、异欧前胡素、β－谷甾醇、豆甾醇和山柰酚与RA疾病密切相关，推测这些可能是治疗RA的核心成分。有研究发现，儿茶素能够下调成脂因子和炎症因子的基因表达，从而减轻炎症反应。异欧前胡素可通过抑制炎症介质释放，降低TNF－α及IL－6等的含量发挥抗炎作用，并对脂多糖诱导大鼠成纤维样滑膜细胞具有较强的增殖抑制作用，分子对接研究显示，其与RA疾病相关的靶点基因前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）具有良好的结合活性，从而发挥抗炎作用。β－谷甾醇是一种植物甾醇，广泛存在于植物体中，是多种中药植物的重要组成成分，现代研究发现其具有抗炎、抑制免疫反应、抗肿瘤等药理作用。此外，β－谷甾醇可以缓解胆固醇代谢和炎症反应，提高抗氧化防御能力，故其对RA的治疗作用是综合性的。吴力超等运用网络药理学和细胞实验研究发现，豆甾醇可能作用于MAPK3等靶点调控雌激素信号通路，发挥其抗炎作用。豆甾醇能够改善胶原诱导的关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠的临床严重程度，其治疗效果与减少关节破坏和改善组织学改变有关，豆甾醇还显著抑制促炎介质TNF－α、IL－1β以及IL－6等的表达，从而对CIA大鼠的关节炎症发挥较好的治疗效果。山柰酚存在于多种中草药中，具有抗氧化损伤、抗炎及免疫调节等多种药理活性，能够改善RA的关节炎症。潘东梅研究发现，山柰酚能有效缓解CIA小鼠关节炎症状，抑制滑膜炎症、关节软骨及骨质破坏，对RA的滑膜炎症及随后的关节破坏均有一定的治疗作用。通过筛选得到“核心药物组合－疾病”的共有靶点64个，获得包括IL－1β、PPARG、AKT1、IL－6以及TNF等在内的11个核心靶点基因。其中IL1β是IL－1家族中最重要的成员之一，其在细胞免疫激活中发挥调节作用，参与机体炎症反应和某些抗肿瘤生理过程，可通过刺激各种促炎介质的分泌来诱导坚实的促炎活性，以细胞凋亡、焦亡、铁死亡等多种方式调节细胞死亡。研究表明，IL－1β能够通过诱导软骨细胞凋亡和细胞外基质降解，改变软骨细胞的表型，导致软骨破坏，还可通过增加非破骨细胞中的类胰岛素生长因子2（Insulinlike Growth
Factor2，IGF2）和趋化因子的表达，以促进破骨细胞的生成。PPARG是一种配体激活的转录因子，可调节参与炎症、骨生物学、脂质稳态的基因，可能对孕妇在怀孕期间和分娩时的某些细胞和免疫参数产生影响。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞生长、增殖、代谢和存活中起关键作用，其单核苷酸多态性与多种免疫性疾病相关。研究发现，靶向下调AKT1的表达可抑制骨关节炎软骨细胞增殖，促进细胞凋亡。IL－6能调控多种细胞生长和分化，对免疫应答、急性期反应和造血功能有调节作用，在机体抗感染免疫反应中发挥着重要作用，参与各种风湿性疾病的发病机制。研究发现，靶向抑制IL－6除了可延缓骨骼和关节破坏外，还可实现骨修复。TNF是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，具有多种生物学活性，作为重要的炎症因子，可诱导IL－6的表达及参与骨质破坏。研究显示，对抗TNF治疗有强效反应的RA患者在基线时表现为免疫途径激活，而抗TNF治疗后免疫途径激活减少，TNF还可控制辅助性T细胞的发育、抗体的产生及促进破骨细胞分化。KEGG富集结果显示共获取137个通路，其中Toll样受体信号通路（Toll－like receptor signaling pathway）、白介素－17信号通路（IL－17 signaling pathway）和肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等为主要的富集通路。Toll样受体（Toll like receptor，TLR）是一种跨膜蛋白和模式识别受体之一，通过宿主细胞释放并触发各种细胞内途径，从而产生促炎细胞因子、趋化因子以及共刺激分子的表达，而功能失调的TLR参与RA慢性炎症状态的形成。研究显示，通过抑制Toll样受体信号通路，可改善CIA大鼠症状，降低炎症反应，并促进关节滑膜组织细胞的凋亡。IL－17作为一种重要的促炎症细胞因子，由辅助性T细胞及先天性免疫细胞等分泌，在自身免疫性疾病的预防与治疗方面起重要作用，靶向抑制IL－17通路能够改善慢性免疫介导的炎症性疾病。研究发现，通过抑制TNF信号通路中核因子抑制蛋白α（IKBα）、IκB激酶β（IKKβ）及核转录因子－κB（NFκB）mRNA相对表达量及TNF－α、IL－6、IKKβ、NF－κB蛋白相对表达量能够减轻炎症，且随着抑制剂含量的升高，其治疗效果越好。因此，通过干预以上通路可调节相关细胞因子的表达，从而改善炎症水平，对临床有一定参考价值。综上所述，本文通过数据挖掘结合生物信息学的方法，拟定《赤水玄珠》中孙氏辨治痹证的核心用药配伍，即黄芪、当归、白芍、人参、防风，全方共奏益气通经、祛风止痛之功效。对这一核心药物组合在痹证治疗中的活性成分、作用靶点、生物过程、细胞组分、分子功能及信号通路进行初步探索和阐述，以期揭示其在痹证治疗过程中的机理，并为痹证临床辨证论治提供部分理论借鉴。本研究以理论为主，由于生物信息学是建立在已有中药数据库基础上的，仍有一些活性成分、作用靶点等尚未发掘出来，以后还需开展较多动物实验和临床试验以进一步为“黄芪、当归、白芍、人参、防风”这一组方治疗痹证提供科学理论依据。文章来源：《贵州中医药大学学报》2024年3月第46卷第2期
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