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自由基鉴别实验（三）：超氧阴离子的六种检测方式

科学   2022-04-07 18:46  



 这篇文章是17年发表在CHEMICAL REVIEWS上的综述，文章总结了活性氧（ROS）的检测方法和产生机制，即超氧阴离子自由基（•O2−）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）和羟基自由基（•OH)在光催化方面的研究全面。即使对于不做光催化方面研究的人来说，文中介绍的各种ROS的检测方式绝大部分是通用的，具有一定的参考意义，可以帮助大家在多维度判断某种自由基是否存在。本篇推送正文主要介绍下•O2–的检测方法（有补充），在文末有该文献原文链接、其它自由基简介等。            

 

 




超氧阴离子的检测方式介绍


•O2−可以通过过硫酸根的转化或光催化过程中半导体的光生电子还原O2产生。此外，半导体的导带电位应该比O2/•O2− 的还原电位为负（−0.33 V，vs. NHE），这样光生电子可以与O2结合形成•O2−。本次主要介绍一些检测超氧阴离子的检测方法。
超氧阴离子的检测方法[1]
（1）猝灭剂实验
（2）自旋捕集ESR：DMPO易先与羟基自由基结合
（3）光吸收：紫外检测较难（吸收系数不大），红外检测定量较费劲
（4）直接ESR：通过在低温下与金属离子配位才能得到信号
（5）显色反应：可能会发生显色剂被电子还原的现象，应结合厌氧实验进行
（6）化学发光：可能较为适合（光照结束后加入试剂）

 



1 猝灭剂实验


超氧阴离子的常用猝灭剂是对苯醌和氯仿，但是氯仿是难溶于水的有机液体，因此在水相实验过程中选择对苯醌作为自由基猝灭剂更为常见。对苯醌与超氧阴离子的结合速率大概为1.0× 109 M-1s-1 [2]。JM Monteagudo等人使用草酸铁诱导的紫外线光-芬顿系统降解三种酚类化合物（即没食子酸、对香豆酸和原儿茶酸）的混合物，当体系中加入2 mM对苯醌时，体系的降解率从原来的88%降至64%c[3]。P. Raja等人在TiO2光降解木质素模型化合物3-甲氧基-4-羟基苯基甲基甲醇（3M-HC）的过程中加入0.25 mM对苯醌，3M-HC的去除率从未加对苯醌时的100%降至30%[4]。含有这类超氧阴离子猝灭实验的文章有很多，我就不做过多举例，感兴趣的可以自己去查查看。
个人思考（只做参考）：对苯醌的加入在很多情况下都会或多或少地引起降解体系中污染物的去除率下降，但这能否就直接作为超氧阴离子是主要氧化物质的实验结论呢？我个人认为是不充足的，对苯醌实际上也是一类有机化合物，其加入就相当于在原本的降解体系中引入了新的有机污染物。当这种“新的有机污染物”浓度较高时，很有可能就作为体系中自由基的主要攻击目标，消耗体系中的自由基，进而导致目标污染物去除率降低。此时就应该结合ESR/EPR表征实验进行验证，验证超氧阴离子是否存在，并在有条件的情况下进行不同浓度对苯醌猝灭的实验探索，来确认最佳猝灭剂浓度。
在不同浓度对苯醌存在下，其污染物降解情况可能是不同的。在部分实验中会出现低浓度对苯醌没有抑制效果，当浓度扩大百倍后就产生了抑制。因此，建议对苯醌浓度建议参考现有研究领域的文章中的常用浓度，并以此为基础进行浓度梯度实验。比如，在含氧化剂的体系中，可以以氧化剂浓度为参考指标，以1:1、1:5、1:10进行对苯醌梯度实验。举例而言，在我的芬顿体系中，过氧化氢浓度为2 mM，那猝灭剂实验中对苯醌浓度可以为2 mM、10 mM以及20 mM，至于为什么不选择1:100，即100 mM的浓度，主要是考虑对苯醌的溶解度。若对苯醌加入较多，难以溶解，其定量和测定就较为困难，并且过滤也会堵塞滤头。

 



2 用ESR自旋捕集法检测


如图1A所示，通过利用诱捕试剂DMPO（5,5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物）可以用ESR检测水溶液中的•O2–。然而，与•OH相比，DMPO与•O2–和•O2H的反应速率极小。DMPO与•O2–和•O2H的速率常数分别为2-170 M-1s-1和6.6 × 103 M-1s-1，而与•OH的速率常数据是（1.9-4.3）×109 M-1s-1。此外，众所周知，DMPO的•O2–加合物非常不稳定（寿命为0.5-1.3分钟），它会转化为•OH加合物（图5A）。尽管在最近的工作中，对Bi2MoO6光催化剂的检测是成功的，但在另一份报告中，对TiO2光催化剂的•O2–检测失败了。
除了DMPO，还有一些自旋捕集试剂，如DEPMPO（5-二乙氧基磷酰-5-甲基-1-吡咯啉N-氧化物）、BMPO（5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉N-氧化物）和CYPMPO（5-（2，2-二甲基-1，3-丙氧基环磷酰）-5-甲基-1-吡咯啉N-氧化物），其化学结构见图5B。DEPMPO和BMPO与•O2–的加合物的寿命分别超过10分钟和23分钟。为了检测光催化中的•O2–和-OH，BMPO已被应用于CdS和ZnS光催化剂，CYPMPO被用于涂有羟基磷灰石的TiO2光催化剂。
图1. （A）用自旋捕集试剂DMPO检测•O2–的反应和进一步分解；（B）•O2–的自旋捕集试剂：BMPO、DEPMPO和CYPMPO的化学结构

 



3 超氧阴离子的光吸收


在紫外（UV）光谱中，•O2–在245nm处有光吸收且摩尔吸收系数为2350 M-1 cm-1，但由于吸光度小，很难直接测量溶液中的•O2–吸光度。在•O2–质子化时，即对•O2H，吸收峰出现在225 nm处，吸收系数下降到1400 M-1 cm-1。
在红外（IR）光谱中，•O2–的吸收带在1050-1200 cm-1或1005-1016 cm-1。对于TiO2在水中的光催化作用，在900-1100 cm-1处出现的宽吸收带被认为是•O2–吸附在Ti4+上[5]。

 



4 由ESR直接观察超氧阴离子


•O2–的自由态无法通过ESR直接观察到，如图2所示，未配对电子所在的两个轨道πx*和πy*的能级具有相同的位置。因此，为了呈现ESR信号，需要在πx*和π y *轨道之间产生能量差以解决简并性，这可以通过两个轨道之一吸附金属离子来实现。•O2–与金属氧化物的稳定配位状态可以通过低温冷冻样品获得，然后可以观察到ESR。
图2. O2、1O2、•O2–和O22–的分子π*轨道以及•O2–和H2O2之间的关系

 



5 与四氮唑的颜色反应


硝基蓝四氮唑（NBT，2,2′-二对硝基苯-5,5′-二苯基-（3,3′-二甲氧基）-4,4′-双苯基氯化四氮唑）是一种还原反应的指标，其还原电位为-0.05 V。由于被•O2–还原，黄色的NBT变成了蓝色的Formazan，如图3所示，它已被用于检测光催化中的•O2–。然而，由于蓝色产物吸附在光催化剂的表面，产物的低溶解度和反应的低选择性成为一个问题。然后，一种具有较高水溶性的类似试剂，如XTT（2,3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺酸苯基）-2H-四唑-5-甲酰），已被用于光催化反应，其中产生的XTT-formazan是通过溶液在470 nm处的吸光度监测的。然而，这种着色试剂可能会被传导带上的光诱导电子或捕获的电子所还原。由于捕获的电子有时在停止光照后仍然存在，所以很难确认还原是否真的是由•O2–发生的，除非在没有O2的情况下着色被抑制。
图3. 用着色试剂NBT检测•O2–的反应

 



6 化学发光


在化学发光方法中，激发的分子是通过与•O2–反应产生的。与鲁米诺和MCLA（6-（4-甲氧基苯基）-2-甲基-3,7-二氢咪唑[1,2-a]吡嗪-3-酮盐酸盐）的反应分别显示在图4的A和B部分。由于光发射的测量可以敏感地进行，化学发光法可以检测非常少量的•O2–。用鲁米诺化学发光法对•O2–的检测极限估计为0.1 nM。
图4. 用（A）鲁米诺和（B）MCLA检测•O2–的化学发光反应
在实验中，这些化学发光探针分子的水溶液可以在停止光照后立即加入光催化剂悬浮液中，以检测产生的•O2–。通过这种检测方法，可以避免探针分子的光催化氧化的影响，因为•O2–的寿命很长。由于生成的•OH和1O2被猝灭，可以预期对检测没有影响。如果探测分子鲁米诺在辐照过程中存在，它将被氧化，并通过与H2O2的反应观察到化学发光。实际上，鲁米诺存在的光催化反应是通过激光脉冲激发来分析的，其过程很复杂。
使用鲁米诺有一些限制，因为一些金属氧化物如SiO2在碱性溶液中分解，并在黑暗条件下与鲁米诺发生化学发光。在中性pH值下，可以用MCLA代替鲁米诺来检测•O2–。尽管MCLA也与1O2产生化学发光，由于1O2的寿命很短，在停止辐照后可以选择性地检测•O2–。

 



其它ROS的检测方式



 
该文章介绍的其它ROS的检测方式:

 在第4节介绍了H2O2的检测方法

在ROS中，H2O2是唯一的稳定分子。因此，在其他ROS衰变后，可以单独检测到H2O2。在1927年的早期报告中，通过使用碘化物法，H2O2被分析为与ZnO粉末光催化反应的产物。目前，已应用多种方法检测光催化中的H2O2，主要分为（1）在UV和IR区域的直接吸收（4.1.1节）、（2）着色（4.1.2节）、（3）荧光探针（4.1.3节）、（4）化学发光法（4.1.4节）。 

在第5节介绍了1O2的检测方法

由于单线态氧1O2是O2的激发态，它可以在不参与化学反应或电子转移的情况下失活成原来稳定的O2。1O2 (1Δg态)在空气中的寿命为几十毫秒，而在H2O中则短至3μs。因为寿命是由能量转移到周围的振动能级决定的分子，它在D2O中变长为68μs。为了确认1O2的存在，有时使用D2O代替H2O。1O2的检测方法分为（1）直接发射（第5.1.1节）、（2、3）电子磁共振（第5.1.2和5.1.3节），（4）化学发光（第5.1.4节）、（5）荧光探针方法（第5.1.5节）。1O2特有的其他反应（第5.1.6节）。

 

在第6节介绍了•OH的检测方法

在各种活性氧中，•OH的反应性相当高，其中•OH对各种化合物的反应速率常数几乎是扩散极限。因此，OH自由基通常被认为是光催化分解最有效的反应物。•OH在光催化中使用的检测方法是（1）直接荧光（第6.1.1节），（2-4）各种ESR观察（第6.1.2、6.1.3和6.1.4节），（5）荧光探针（第6.1.5节）、（6）化学发光（第6.1.6节）和（7）其他方法（第6.1.7节）。



参考文献 

[1]       Y. Nosaka, A.Y. Nosaka, Generation and Detection of Reactive Oxygen Species in Photocatalysis, Chem. Rev. 117 (2017) 11302–11336. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.7b00161.
[2]       P.S. Rao, E. Hayon, Redox potentials of free radicals. IV. Superoxide and hydroperoxy radicals . O2- and . HO2, J. Phys. Chem. 79 (1975) 397–402. https://doi.org/10.1021/j100571a021.
[3]       J.M. Monteagudo, A. Durán, I. San Martin, A. Carnicer, Roles of different intermediate active species in the mineralization reactions of phenolic pollutants under a UV-A/C photo-Fenton process, Appl. Catal. B Environ. (2011). https://doi.org/10.1016/j.apcatb.2011.05.034.
[4]       P. Raja, A. Bozzi, H. Mansilla, J. Kiwi, Evidence for superoxide-radical anion, singlet oxygen and OH-radical intervention during the degradation of the lignin model compound (3-methoxy-4-hydroxyphenylmethylcarbinol), J. Photochem. Photobiol. A Chem. 169 (2005) 271–278. https://doi.org/10.1016/j.jphotochem.2004.07.009.
[5]       Y. Kakuma, A.Y. Nosaka, Y. Nosaka, Difference in TiO 2 photocatalytic mechanism between rutile and anatase studied by the detection of active oxygen and surface species in water, Phys. Chem. Chem. Phys. 17 (2015) 18691–18698. https://doi.org/10.1039/C5CP02004B.


回复 超氧阴离子 可获得该文献的PDF版。点击 阅读原文 可跳转到该文献网页版。

以上就是这期的主要内容，感谢观看！如果觉得有帮助，可以关注、点赞、转发。期待下期再见！


—END—




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