参比制剂解析系列-注射剂（5）
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科技
2024-10-07 22:00
湖北
本类项下的辅料解析并不好做，检测过程容易受到干扰，测定结果的准确度不能完全保证，所以测定结果主要供参考，建议结合其他辅料的测定结果，共同判断处方中的比例。
聚山梨酯类的辅料有多种型号，根据中国药典的收载，分为聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、聚山梨酯80（Ⅱ），每种的脂肪酸组分都不一样，其他的差异不大，将这几种辅料的脂肪酸组分信息简单汇总如下：名称 | 来源
| 含量测定方法 |
聚山梨酯20 | 本品系月桂山梨坦和环氧乙烷聚合而成的聚氧乙烯20月桂山梨坦 | 含月桂酸应为40.0%~60.0%，含肉豆酸应为1.0%~ 25.0%，含棕相酸应为7.0% ~15,0%，含己酸、辛酸、类酸、硬脂酸、油酸与亚油酸分别不得过1.0%、10.0%、10.0%、7.0%、11.0%与3.0% |
| 聚山梨酯40 | 本品系棕榈山梨坦和环氧乙烷聚合而成的聚氧乙烯20棕榈山梨坦 | 含棕榈酸应不低于92.0% |
聚山梨酯60 | 本品系硬脂山梨坦和环氧乙烷聚合而成的聚氧乙烯20硬脂山梨 | 含硬脂酸应为40.0%~60.0%，硬脂酸和棕榈酸之和应不低于90.0% |
聚山梨酯80 | 本品系油酸山梨坦和环氧乙烷聚合而成的聚氧乙烯20油酸山梨坦 | 含油酸应不低于58.0%，含肉豆范酸、棕相酸、棕相油酸、硬脂酸、亚油酸与亚麻酸分别不得过5.0%、16,.0%、8.0%、6.0%、18.0%与4.0% |
聚山梨酯80（Ⅱ） | 本品系植物来源油酸山梨坦和环氧乙烷聚合而成的聚氧乙烯20油酸山梨坦 | 含油酸应不低于98.0%，含肉豆酸、棕相酸、棕相油酸、硬脂酸、亚油酸与亚麻酸均不得过0.5%。
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根据汇总表，种类目前有以上5种，一般来说，目前市面上常见的可用于注射液的聚山梨酯产品主要是聚山梨酯20和聚山梨酯80。因此大家主要解析的方向主要进行聚山梨酯的定量和定性。由于处方不同，不同品种聚山梨酯系列的产品含量可能在一定的范围内波动，根据美国FDA批准药物非活性成分数据库，其重量比在0.02%~5%波动，可以以此为初步判断标准，进行研究，确认测定结果是否合理。根据测定机理不同，其含量测定方法主要分为以下几种：本法来源于药典四部的3203的《聚山梨酯80残留量测定法》，其测定机理是聚山梨酯80中的聚乙氧基(Polyethoxylated)和铵钴硫氰酸盐反应形成蓝色复合物，可溶于二氯甲烷，用比色法测定二氯甲烷层中聚山梨酯80含量。根据上表中汇总的信息可知，聚山梨酯20是聚氧乙烯20月桂山梨坦，聚山梨酯80是聚氧乙烯20油酸山梨坦，两者均含有聚氧乙烯，因此均可使用此方法进行检测，具体信息如下：测定法 量取供试品1.0ml于离心管中，加乙醇-氯化钠饱和溶液5ml，摇匀，以每分钟3000转离心10分钟，取上清液，再用乙醇-氯化纳饱和溶液1.0m小心冲洗管壁，洗液与上清液合并，以每分钟3000转离心10分钟，上清液置55°C水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.1 ~0.5ml，加1m水溶解。准确加入二氯甲烷2.0ml、硫氰钴铵溶液(称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200ml) 3.0m，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，弃上层液，照紫外可见分光光度法(通则0401)，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。以上述聚山梨酯80对照品溶液系列浓度(μg/ml)对其应的吸光度作直线回归，相关系数应不低于0.98，将供试品溶液吸光度代入直线回归方程，求得供试品溶液中聚山梨酯80含量 （μg/ml) 本方法适用于制剂产品中，尤其是蛋白质产品中的聚山梨酯80/20检测，在前处理步骤中使用乙醇-氯化钠饱和溶液是为了对产品中的蛋白质进行沉淀离心，除去潜在的干扰，然后使用吹扫浓缩的方法富集产物 ，进行衍生检测。
若产品中无蛋白质产品可以考虑去掉或优化此步骤（乙醇-饱和氯化钠萃取）；若产品中有蛋白质类产品，应当注意到以下几点：①若浓度超过100ug/ml，反应结束后，可能会发生无法顺利分层的现象，需要再次稀释，增加分层的程度；②不同蛋白质类型的干扰不同，大分子蛋白（糖蛋白）的干扰比多肽的干扰严重，解决方向是使用水解酶水解后测定；③蛋白质对检测结果均可能对结果产生较大的影响，应注意进行加标试验确认；④目前有优化的方法是是使用三氯甲烷替代二氯甲烷，可以减少乙醇-饱和氯化钠萃取的步骤，降低过程中萃取操作导致的平行差的问题，具体待试验确认。由于高效液相色谱法专属性好，准确度高，重复性佳，可以有效分离聚山梨酯和其他辅料，对其进行准确定量，因此在紫外分光光度法干扰比较大的情况下，可以考虑更换为此方法。根据聚山梨酯的结构式，其无紫外吸收，无可电离基团，因此推荐高效液相色谱（简称HPLC）搭配通用型的检测器，例如示差折光（简称RI）、蒸发光散射（简称ELSD）、电喷雾（简称CAD）、飞行时间质谱（简称TOF）进行检测。从设备造价来讲TOF＞CAD＞ELSD＞RI，从准确度讲TOF＞CAD＞ELSD＞RI，从可获得性讲，RI＞ELSD＞CAD＞TOF，其适用范围略有差异，RI仅适用于等度洗脱，不适用于梯度洗脱，其他三种检测其可以同时适用于等度洗脱和梯度洗脱，大家可以根据自己实验室的条件进行选择。
根据聚氧乙烯系列的结构特征，发现其有较长的脂肪链，提示其有一定的保留，需要一定比例的有机相才能洗脱出来；同时由于聚氧乙烯无明显的酸碱基团，因此可以根据注射液产品中API和辅料的酸碱性，选择合适的流动相，使聚氧乙烯与API或辅料保持合适的分离度，方便对聚氧乙烯进行准确定量。简单汇总目前公开的文献，发现最简单的色谱条件如下，大家可以在此基础上，根据实验室的条件进一步的开发和优化方法：C18色谱柱（250×4.6mm,5um），流速1ml/min，柱温28℃，甲醇-水（80:20），ELSD载气量2.5Lmin，漂移管温度60℃，雾化压力0.5mPa，聚氧乙烯20的保留时间约4min，聚氧乙烯80的保留时间可能比较类似。由于不同厂家生产的聚氧乙烯质量差异较大，即使在确定组分的含量后，其脂肪酸组成可能会有较大的差异，因此建议增加定性检测，尽量选择脂肪酸组成与原研接近一致的产品，具体检测方法，建议直接参考药典的检测方法。其检测机理和注意事项类同于油脂类检测（详见4.1.1）。
脂肪酸组成 取本品约0.1g，置50ml锥形瓶中，加2%氢氧化钠甲醇溶液2ml，在65℃水浴中加热回流30分钟，放冷，加14%三氟化硼甲醇溶液2ml，再在水浴中加热回流30分钟，放冷，加正庚烷4ml，继续在水浴中加热回流5分钟，放冷，加饱和氯化钠溶液10ml，振摇，静置使分层，取上层液，用水洗涤3次，每次4ml，上层液经无水硫酸钠干燥后，作为供试品溶液。照气相色谱法(通则0521)试验。以聚乙二醇-20M为固定液的石英毛细管柱(0.32mmx30m,0.50um)为色谱柱，起始温度为90℃，以每分钟20℃的速率升温至160℃，维持1分钟，再以每分钟2℃的速率升温至220℃，维持20分钟;进样口温度为190℃;检测器温度为250℃。聚氧乙烯20 分别称取己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯与亚油酸甲酯对照品适量，用正庚烷溶解并制成每1ml中各约含己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯0.1mg，肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯各约含1mg的混合溶液，取1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，理论板数按月桂酸甲酯峰计算不低于10000，各色谱峰的分离度应符合要求。取供试品溶液1μI注入气相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算(峰面积小于0.05%的峰可忽略不计)。含月桂酸应为40.0%~60.0%，含肉豆蔻酸应为14.0%~25.0%，含棕榈酸应为7.0%~15.0%，含己酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、油酸与亚油酸分别不得过1.0%、10.0%、10.0%、7.0%、11.0%与3.0%。聚氧乙烯80 分别称取肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯与亚麻酸甲酯对照品适量，加正庚烷溶解并制成每1ml中各约含1mg的溶液，取1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，理论板数按油酸甲酯峰计算不低于10000，各色谱峰的分离度应符合要求。取供试品溶液1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算(峰面积小于0.05%的峰可忽略不计)，含油酸应不低于58.0%，含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸与亚麻酸分别不得过5.0%、16.0%、8.0%、6.0%、18.0%与4.0%。4.1.2 泊洛沙姆
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泊洛沙姆是一类具有良好生物相容性的由聚氧乙烯( PEO) 和聚丙乙烯( PPO) 组成的 PEO-PPO-PEO 三嵌段共聚物，具有良好的水溶性、表面活性、反向热敏胶凝性质和安全性。目前常用的有两种型号分别是188和407两种型号，根据FDA药物非活性成分数据库，目前能用于注射液的只有188型号，其单位剂量用量范围在2.2~6mg之间，具体到不同品种可能会存在差异，仅供参考。根据药典的定义，泊洛沙姆188为α-氢-ω-羟基聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)a嵌段共聚物。由环氧丙烷和丙二醇反应，形成聚氧丙烯二醇，然后加入环氧乙烷形成嵌段共聚物。在共聚物中氧乙烯单元(a)为75~85，氧丙烯单元(b) 为25~30，氧乙烯(EO) 含量79.9%~83.7%，平均分子量为7680~9510。从中可以看到泊洛沙姆188中的含量以氧乙烯(EO)来进行表征，因此有以下方法可以用于测定泊洛沙姆188的含量，根据测定机理不同，其含量测定方法主要分为以下几种：通过测定泊洛沙姆188中的氧乙烯的含量来间接推算泊洛沙姆188的含量，可以参考以下药典中进行实验：![]()
药典中的氧乙烯含量是采用核磁法检测，在逆向解析检测注射剂中的氧乙烯含量时，若为固体冻干粉末，可以直接参考上述方法检测；若为注射液，可能会由于注射液中的水分稀释，泊洛沙姆含量较低，导致灵敏度较低，测定氧乙烯量不够准确；解决方案为采用冻干法，定量移取一定体积的注射液，进行冻干，然后采用含1%4，4-二甲基-4-硅杂戊磺酸钠的氘代水1ml或者含四甲基硅烷的氘代三氯甲烷1ml溶解后测定，然后根据测定的氧乙烯结果反推出泊洛沙姆188的含量。由于泊洛沙姆188是不同聚合度的混合物，平均分子量为7680~9510，常规的反相色谱柱难以保留，因此需要特殊的色谱柱，例如利用空间尺寸排阻功能的凝胶色谱柱和聚苯乙烯/二乙烯苯(PS/DVB)色谱柱；同时由于泊洛沙姆188与聚氧乙烯比较类似，既无紫外吸收基团又无可电离基团，其检测器的选择详见上文，具体根据实验室的现有配制进行试验；其流动相可以根据注射液产品中API和辅料的酸碱性，选择合适的流动相，使聚氧乙烯与API或辅料保持合适的分离度，方便对聚氧乙烯进行准确定量。简单汇总目前公开的文献，发现最简单的色谱条件如下，大家可以在此基础上，根据实验室的条件进一步的开发和优化方法：凝胶色谱柱（7.8*300mm），流速1.0ml/min，柱温30℃，水-乙腈（80:20），ELSD载气量1.9Lmin，漂移管温度50℃，泊洛沙姆188的保留时间约7~8min。--![]()
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