摘要
基因治疗为单基因遗传病、癌症和罕见病患者带来了希望。腺相关病毒（AAV）因其低致病性和工程化潜力，已成为理想的基因递送载体。然而，AAV载体引发的免疫反应、基因包装能力和组织转导效率等挑战限制了其广泛应用。本文讨论了与AAV相关的免疫反应、抗AAV中和抗体（NAbs）的影响及其应对方法，并提出了攻克免疫挑战的策略。
引言
近年来，基因治疗的快速发展为许多难治疾病带来了新的希望。腺相关病毒（AAV）由于其低致病性和高效的基因递送能力，成为基因治疗领域的热点。AAV载体能够将治疗基因递送到目标组织，并在分裂和非分裂细胞中实现长期表达，尤其适用于肝脏、视网膜和中枢神经系统等组织。此外，AAV具有较低的免疫原性，优化的生产工艺也确保了高滴度和高纯度的载体生产。
AAV载体在不同细胞类型中的递送能力取决于其多样的血清型，不同血清型的AAV在衣壳蛋白的氨基酸序列上存在差异，导致其在宿主细胞受体结合和组织趋向性上的差异。AAV2是最常见的血清型，与其他血清型的氨基酸序列相似性较高。研究发现，不同AAV血清型之间的趋向性差异主要由衣壳蛋白序列和宿主细胞受体决定。
1. rAAV基因递送的挑战
虽然AAV载体因其独特的优势成为基因治疗的首选载体，但在实际应用中仍面临一些挑战。首先，AAV载体在体内可能引发宿主的免疫反应，特别是在高剂量或系统性给药时，抗AAV中和抗体（NAbs）的存在会显著降低载体的转导效率，从而影响基因治疗的效果。NAbs可以在自然感染AAV后形成，也可能在AAV载体给药后产生。这些抗体会与AAV载体结合，阻止其与靶细胞受体的结合，或者在内化后抑制转导过程。
图1 NAbs的典型作用机制
此外，不同人群中AAV血清型的NAbs流行率存在显著差异。研究表明，抗AAV2 NAbs在全球范围内最为常见，其次是抗AAV1、AAV8和AAV9。流行率还受到地理、种族和年龄等因素的影响。随着年龄增长，抗AAV NAbs的血清流行率逐渐增加，特别是在儿童和青少年中。
抗-AAV中和抗体（NAbs）的血清流行率
了解AAV血清型的NAbs流行率对于基因治疗的成功至关重要。多项研究显示，不同地区和人群中抗AAV NAbs的流行率差异显著。一项针对来自四大洲10个国家的大量基于人群的研究显示，在所有地区中，抗-AAV2 NAbs是所有地区（30%-60%）中最普遍的抗体，其次是抗-AAV1、抗-AAV7和抗-AAV8 NAbs。与其他国家相比，美国抗-AAV1、抗-AAV7和抗-AAV8 NAbs的流行率较低。在另一项针对美国和欧洲健康志愿者的研究中，尽管存在一些地区差异，但抗-AAV2和抗-AAV8 NAbs的流行率很高。另一项对来自10个国家（澳大利亚、加拿大、法国、德国、意大利、日本、韩国、西班牙、英国和美国）的非基因治疗试验参与者的观察性、回顾性研究显示，抗-AAV1 NAbs最为普遍（74.9%），其次是AAV6（70.1%）和AAV5（63.9%）。然而，根据检测中使用的稀释度，流行率有所不同，AAV5的血清流行率最低。总体而言，所有研究的AAV血清型的流行率在韩国最高，在澳大利亚和美国最低。
种族差异也影响抗AAV NAbs的流行率。在美国的一项研究中，黑人和西班牙裔个体对大多数AAV血清型的NAbs流行率较高。对来自10个国家的非基因治疗试验参与者的研究表明，亚洲人的血清流行率比非亚洲参与者更高。
此外，随着年龄增长，抗AAV NAbs的血清流行率也有所增加。一项研究检查了美国从出生到青少年期（N=752）的抗-AAV NAbs血清流行率，报告称抗-AAV2和抗-AAV8 NAbs在新生儿中较高（分别为59%和36%），但在7至11个月大的婴儿中大幅下降，然后在3至18岁的儿童和青少年中再次增加。
一些研究提出，性别可能影响抗-AAV NAbs的流行率。在中国健康女性中，抗-AAV1、抗-AAV5和抗-AAV8 NAbs的流行率显著高于男性。
AAV的NAbs血清流行率在疾病状态和健康人群之间也存在差异。有证据表明，患者的血清阳性可能受到疾病性质和/或接受的治疗的影响。例如，抗-AAV2 NAbs在包括血友病、囊性纤维化、类风湿性关节炎和原发性Sjögren综合征在内的疾病状态中是最常见的抗体。接受血浆产品的血友病A患者中，抗-AAV8 NAbs有所增加，以及暴露于丙型肝炎的患者中，抗-AAV5和抗-AAV8 NAbs有所增加。
2. 为rAAV基因治疗做准备
在准备进行AAV基因治疗时，筛查抗AAV NAbs是一个重要步骤。目前有几种方法用于检测抗AAV NAbs，包括基于细胞的检测和酶联免疫吸附试验（ELISA）。这些方法尚未完全标准化，但在实际应用中起到了关键作用。
基于细胞的检测方法，如转导抑制检测，通常使用报告基因来测量转导水平。这些方法通过测量报告蛋白的活性来评估NAbs对AAV载体转导的抑制能力。虽然这种方法重现了临床环境，但输出结果可能与实际的生物学反应不完全一致。
另一种常用的检测方法是中和检测，它测量AAV载体与目标细胞的结合能力。中和检测通过测量报告蛋白的活性来评估NAbs对AAV载体结合的抑制作用。这种方法相对快速，但不直接提供整体基因转移效率或转导的信息。
总抗体检测，如ELISA，可以测量抗体与AAV衣壳或衣壳蛋白的结合。尽管这种方法不直接测量中和活性，但能够提供总抗AAV抗体水平的测量。总抗体检测的结果通常与NAbs水平相关，但需要进一步研究以确定其在AAV基因治疗中的适用性。
图2 AAVs免疫的检测方法
3. 减轻抗AAV NAbs的策略
针对抗AAV NAbs的高流行率，开发有效的应对策略对于扩大基因治疗的适用人群至关重要。在低滴度NAbs存在的情况下，给予高载体剂量可能是克服NAbs影响的一种方法。然而，高剂量给药可能引发全身性炎症反应，因此需要谨慎应用。
改变给药方式或途径也是一种可行策略。例如，门静脉定向注射AAV8载体并用生理盐水冲洗可以有效减少抗AAV8 预存抗体的影响。此外，在预先存在抗-AAV NAbs的患者中，肌肉注射基于rAAV2的血友病B基因治疗已显示出成功的基因递送，表明这种方法不易受到NAbs中和活性的影响。
工程化AAV衣壳或使用血清流行率较低的血清型是另一种策略。定向进化或通过AAV衣壳的突变可以开发出具有不同组织趋向性、免疫逃逸能力和对NAbs敏感性的衣壳。这种方法虽然具有潜力，但在临床前和临床环境中需要进行全面评估。
此外，AAV衣壳的其他非遗传性、化学修饰可能避免体液免疫反应和NAbs的中和。例如，将AAV表面与聚乙二醇链（PEG化）结合可能保护AAV载体免受NAbs的影响。在最终载体配方中包含抗体诱饵，如空衣壳，可能克服NAbs的抑制作用。
为了防止rAAV转导细胞的排斥反应，通常在基因递送期间或之后给予免疫抑制剂，这种方法虽然在抑制抗AAV T细胞反应方面显示出一定有效性，但对预先存在的NAbs的影响有限。血浆置换术和使用预处理免疫球蛋白降解酶也在研究中，但这些方法尚未完全消除NAbs的存在。
减轻rAAV载体给药后体液免疫反应的策略
由于rAAV载体给药后抗AAV NAbs的水平可能显著增加，阻碍相同载体的再次给药，因此开发减轻体液免疫反应的策略非常重要。减少载体剂量是其中一种策略，因为rAAV载体的免疫原性似乎是剂量依赖性的。低剂量载体与广谱免疫抑制剂联合使用可能调控治疗基因的表达并减少免疫反应。
使用组织特异性启动子可以减少转基因的非靶向表达，限制针对治疗基因的免疫反应。有效的策略可能包括多种方法的组合，特别是对于预先存在NAb滴度较高的患者。
4. 儿童患者的考虑因素
对于儿童患者，基因治疗的考虑因素有所不同。3岁以下儿童的抗AAV NAbs血清流行率最低，这可能是一个最佳的治疗窗口。然而，随着肝脏生长和血容量增加，治疗基因的表达可能被稀释，此时可能需要重新给药，或者使用基因组整合或基因编辑方法。
结论
AAV已成为基因治疗的重要载体，尽管面临免疫反应的挑战。了解抗AAV NAbs的流行率和开发有效的减轻策略对于成功实施基因治疗至关重要。进一步研究和标准化检测方法将帮助扩大基因治疗的适用人群，并提高其长期有效性。
参考资料：
1. doi: 10.7150/thno.89380
