文献分享 | 帕金森病等神经退行性疾病的基因治疗

中枢神经系统（CNS）神经元的变性包括包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)。虽然每种神经退行性疾病的确切病因可能各不相同，但它们共同的病理特征是存在神经炎症，这是中枢神经系统内的一种慢性和失调的免疫反应。

神经炎症在NDs发病机制中的作用近年来受到了人们的关注。研究人员已经阐明了免疫系统和神经系统之间复杂的相互作用（图2）。

图2：在NDs发病机制中起关键性的作用的几大因素

中枢神经系统的常驻免疫细胞——小胶质细胞和星形胶质细胞参与了这一过程，释放促炎细胞因子的释放并维持神经元损伤的病理过程；此外，错误折叠蛋白的积累，如AD中的tau蛋白和淀粉样蛋白或PD中的α-突触核蛋白，可以触发和维持神经炎症反应。

治疗NDs的传统方法主要集中在缓解症状上，在减缓或停止疾病进展方面的成功有限例子有限。由于NDs致病机制多面性，再加上人血脑屏障的限制，阻碍了有效的治疗方法的研发。

基因治疗是生物医学研究中的一个新兴领域，它具有调节免疫反应、修复或替换受损神经元，并减轻错误折叠蛋白带来的毒性负担的潜力。通过直接解决神经退行性变的潜在机制，希望达到改善患者的生活质量和减缓疾病进展的目的。

图2 ：环境和气候对NDs疾病的影响

各种NDs疾病发病通常还与细胞内机制有关，包括线粒体功能障碍、蛋白质降解、凋亡和轴突运输缺陷。现有证据表明，由全身脂多糖或病毒感染引起的周围神经系统的强大炎症反应导致随后白细胞从周围迁移到中枢神经系统，导致痴呆和神经炎症。在一次免疫炎症触发后，小胶质细胞的第一次激活发生，促炎介质的产生，从而改变血脑屏障的通透性，外周白细胞随后进入中枢神经系统显示出与小胶质细胞相似的功能。这些相似之处包括激活聚集蛋白、病原体相关分子模式或toll样受体（TLRs）的表达。

图3 ：导致神经退行性疾病的炎症通路(IRG：炎症反应基因IRE：炎症基因表达CR：细胞因子受体T：翻译C：钙调素NR：硝酸盐还原酶）。这一机制证明了氧化应激和神经炎症如何激活小胶质细胞。这一途径涉及到某些细胞内蛋白（mTOR，AKT，p38 MAPK）的磷酸化和激活。这一过程最终导致了NF-κB的泛素化和磷酸化。之后，NF-κB被释放到细胞核，在那里它可能附着在特定的结合位点，触发趋化因子和炎症细胞因子的翻译和转录。此外，线粒体功能障碍导致小胶质细胞释放一些活性氧（ROS），这也是神经元受损的另一个原因。此外，亚硝酸盐和硝酸盐最终由一氧化氮合酶（iNOS）产生，这些化合物共同导致神经炎症。

基因治疗是医学的一个分支，简单的来讲是将功能基因引入细胞以纠正细胞功能障碍或赋予细胞的新的能力。

最初，它被设计为一种治疗方法来治疗遗传性单基因疾病，如囊性纤维化。慢慢的基因治疗的范围逐步扩大到包括更广泛的疾病。

基因疗法的概念最初是由乔舒亚·勒德伯格在1963年提出的。直到20世纪80年代，人类遗传学研究才开始取得重大进展。研究人员利用逆转录病毒载体将新霉素耐药标记基因引入肿瘤浸润的淋巴细胞，这些淋巴细胞从5名转移性黑色素瘤的患者中获取，随后淋巴细胞在体外培养以达到扩增，然后再灌注到相应的患者身体。

基因治疗是将一个功能基因引入基因组，以替代与某种疾病的发病机制有关的异常基因。在该技术固有的几个问题中，一个突出的障碍是将该基因引入干细胞的艰巨任务。因此，一种被称为“载体”的分子转运体被用来促进基因的传递，该载体必须具有几个关键属性：

1. 精确的靶向能力

2. 有效释放适合的目的基因，

3. 能逃避人体免疫系统的识别

4. 具备大量和高浓度纯化的能力，以使大规模生产，提高可用性。

5. 较少的过敏反应或炎症反应。

6. 主要目的是增强正常的生理过程，纠正缺陷，或阻碍有害的活动。不仅要保证病人的安全，还要保证周围环境和健康车的安全。

   
   

虽然病毒载体的有效性已经建立，但最新的研究显示了使用的一些局限性。在质粒中包含病毒遗传物质是一个重要的恶化因素，因为它有可能引起快速的免疫反应，并可能导致肿瘤的转化。

目前，有两种主要的细胞基因修饰方法：使用来自复杂的纳米技术方法的制剂，包括病毒介导和生物化学方法。那些能够捕获遗传物质并在细胞穿透时释放到内质网的聚合物。聚合物包括DNA显微注射、阳离子聚合物、阳离子脂质体和粒子轰击法。在过去三十年的基因治疗研究中，科学家遇到了一些障碍，包括免疫反应和对非目标区域的意外影响。然而，近年来成功获批的基因治疗产品越来越多，凸显了该领域取得的重大进展，并强调了其在未来治疗干预领域日益增长的重要性。此外还有多种基因修饰，包括基因替换、碱基替换、基因缺失和基因敲入。遗传性疾病分子诊断技术最新进展也为新的治疗方法提供了技术上的支持。

目前用于基因治疗试验的基因工具包括：基因编辑系统，如TALENs、CRISPR cas相关核酸酶、MNs和ZFNs。此外，还使用了病毒基因传递载体，包括腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和其他病毒载体。此外，还包括非病毒系统，如裸DNA、mRNA、DNA干扰、RNA干扰、miRNA、适配体和其他类别的RNA寡核苷酸或治疗性DNA。毫无疑问，基因工具的使用已经在个性化医疗和基因治疗领域带来了深刻的转变。

神经炎症在帕金森（PD）病程中的作用研究表明：小胶质细胞和星形胶质细胞在各种物理或化学应激源下都可能发生过度激活。环境神经毒性物质，如锰（Mn）的存在，破坏了位于黑质网状部和纹状体苍白球的神经元和胶质细胞之间复杂的神经通路的讯号系统，导致神经炎症的发生。线粒体功能障碍和神经炎症过程之间的关系高度相关，这两个因素通常被认为是几种神经退行性疾病的共同特征。

多项研究显示通过使用CRISPR-Cas9技术可以达到操纵细胞核基因组和线粒体基因组的一种方法。目前，目前有大量使用CRISPR技术对PD基因治疗的研究。在CRISPR/Cas9技术中使用基因修饰、基因敲除/插入、表观遗传改变和转录激活/抑制等技术，为治疗PD提供了可能性，并使研究该疾病的潜在遗传原因成为可能。

研究发现，在成人受试者中，靶向去除“过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）共激活物蛋白-1α（PGC-1α）”会导致多巴胺能神经元细胞的死亡。PGC-1α是线粒体生物发生的重要控制因子，负责调节细胞内新的线粒体的生成。线粒体转录因子A（TFAM）是参与线粒体生物发生过程的另一个调控因子。它是线粒体转录的关键激活因子。TFAM通过与线粒体启动子DNA的相互作用来调节线粒体拷贝的数量，从而促进了转录过程。此外，TFAM还参与了钙和活性氧（ROS）水平的调节。

基因治疗领域有望逆转几种使人神经退化的疾病；尽管如此，它目前的使用仍受到重大障碍的限制。

原因如下：

复杂的大脑解剖学：大脑组成具有多样化的特点，由于生物学基础研究的突破，一些神经系统疾病的病理生理学改变被发现与大脑中各种细胞亚群的活动存在紧密的联系。小胶质细胞约占脑细胞总数的10-15%，是中枢神经系统内的固有免疫细胞，负责对大脑进行常规监测。少突胶质细胞通过促进轴突的髓鞘化，在中枢神经系统中发挥着至关重要的作用。这一过程涉及在轴突周围形成电绝缘层，通过一种称为跳跃传导的机制使神经得以高效和快速的传递。星形胶质细胞是主要的神经胶质细胞，构成了大脑内的主要细胞群。神经胶质细胞对于维持血脑屏障内紧密连接的结构完整性至关重要。

神经系统疾病表现出不同的病理生理学特征，因此需要使用能够选择性地靶向某些细胞亚群的基因治疗传递方法，为达到基因靶向传递的精准管理，获取大脑的全面的基因表达数据至关重要，目前已经开始使用了多种治疗的方法，包括直接向脑实质注射药物。

血脑屏障的通透性

血脑屏障是维持中枢神经系统稳态和抑制有害化学物质进入大脑的重要保护机制。通过紧密连接组成血脑屏障表现出明显的穿孔和胞吞囊泡的缺乏，这进一步限制了分子通过血脑屏障进入中枢神经系统。

图4：人脑的血脑屏障结构，是介于血液和脑组织之间的对物质通过有选择性阻碍作用的动态界面，由毛细血管内皮及其细胞间的紧密连接、完整的基膜、周细胞以及星形胶质细胞脚板围成的神经胶质膜构成。

被动扩散是一种机制，如果分子具有较小的尺寸或具有脂溶性，它们可以穿过血脑屏障。物质通过血脑屏障可能通过多种机制发生，包括由血脑屏障细胞产生的转运体、受体或载体促进的主动吸收。大脑中有非常复杂的动脉网络，所有的脑细胞都位于距离毛细血管20µm的距离内，保证了整个脑实质的全面灌注。

使用血管内基因传递方法是否能对整个大脑潜在的渗透取决于其穿透血脑屏障的能力。然而，血脑屏障有限的通透性在有效靶向脑细胞方面构成了一个重大障碍。因此，最佳的治疗药物将要具备小分子、高亲脂性和最小的血浆蛋白结合率的特点。

基因治疗的药物剂量和使用的频率

这依赖于选用的特定基因和传递的机制，这为基因治疗药效学和药代动力学的特点提出了挑战。基因治疗的路径包括如下：颈动脉内给药、鼻内、鞘内、玻璃体内注射和肌肉内注射的方法。目前，已有研究表明，通过静脉和颅内给药的途径的有效性能达到最高水平。由于使用方法的便捷，最近的研究工作一直集中在开发使用静脉注射途径的输送系统上。虽然颅内给药确实提供了一种让药物浓度更集中的治疗方法，但人们对药物可能会扩散到大脑的非治疗区域感到担忧。建立基因治疗的药效学和药代动力学特征的另一个挑战是从体外实验到体内研究的进展，以及从小鼠模型到非人类灵长类动物的转移。

图4：基因治疗的的不同路径及益处

1. 颅内局部注射 耐受性良好，允许将治疗基因直接传递到特定的神经元和大脑区域，更少分布到外周器官。AAV是腺相关病毒载体，AAV8, AAV1, AAVrh.10和AAV9是不与硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）相互作用的载体，与与AAV-DJ88、AAV2和AAV6164相互作用的载体相比，在实质内注射时分布在更广泛的区域。

   
   

2. 静脉注射 生理屏障如血脑屏障，分离外周和中枢神经系统组织，为获取治疗基因提出了巨大的挑战。AAV9是一种有效的药物，在静脉给药后成功地通过了这些障碍。这一特性允许在中枢神经系统中广泛表达，以治疗影响多个领域的疾病，并作为额外技术研究和进步的催化剂。此外，对AAV的衣壳 (Capsid)进行工程化修饰的研究已经确定了AAV变异，即AAV-B1、AAV-AS和AAV.PHP.B，似乎优于AAV9。这一发现代表了静脉给药的一个重大进展。这种传递方法有可能引导病毒载体运输治疗基因到身体各种组织中。

   
   

3. 鞘内、胸骨内、脑膜下和侧脑室内注射  鞘内给药的方式在将载体传递到脊髓背根神经节或运动神经元的感觉神经元方面特别有效。该方法已在一些临床前试验中被广泛接受并耐受性良好。临床前研究表明，通过侧脑室内和胸骨内给药传递治疗基因可有效地诱导这些基因在脊髓和脑组织中的表达。这种方法成功地缓解了各种NDs的症状，如渐冻症（ALS）、阿尔茨海默病（AD）和脊髓性肌萎缩疾病（SMA）。
   
   

虽然NDs的基因治疗领域仍处于起步阶段，但从其他疾病中获得的经验可能被有效地用于提高NDs基因治疗的有效性。通过体外方法将治疗性DNA有效运输到哺乳动物细胞早在多年前试验已经完成，但遗传物质的体内管理却受到了许多困难：

1. 循环中存在的治疗性核酸被核酸酶降解，导致治疗基因在生物体内半衰期非常的短。

   
   

2. 感染后将病毒遗传物质整合到宿主基因组中也存在毒性、突变和免疫原性方面的潜在风险。许多研究正在进行以减轻这些风险，使基因治疗得以有效的实施。

   
   

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/ib2emkCoGctSsDX1jGlfEQ

参考文献：

1. Kuldeep Singh，et al.Advances in gene therapy approaches targeting neuro-inflammation in neurodegenerative diseases.Ageing Research Reviews ,2024(98),