细胞培养的核心之一是无菌操作。那么,菌从何而来?
从人、物品以及环境中来。
使用一次性、已灭菌的实验工具能有效降低污染引入的风险,但总有一些工具、总有一些环节是需要反复使用的,而这就需要进行清洁和灭菌。
常见的2种操作是高压灭菌和过滤除菌。
本期内容主要讲一下这两者的区别和注意事项。
选择灭菌方法的基本原则
灭菌方法的选择主要基于物品在高温下的稳定性。
可抗高温的物品,例如玻璃、金属、耐热塑料(PTFE),可采用干热灭菌;热稳定的液体可以采用湿热灭菌,也就是高压蒸汽灭菌;热敏感的素材可以用乙醇或射线灭菌;热不稳定的液体可以采用过滤除菌。
高压灭菌简介
常间的高压灭菌方法是使用灭菌锅加热水提高温度和压力来完成。
其实验条件是将实验工具所处的环境加热至121摄氏度,并维持至少20分钟。由于水蒸气会渗透至整个空间,灭菌结束后需要有一个干燥的过程。
高压蒸汽灭菌适用于热稳定的液体,例如水、盐溶液、或一些成份对热稳定的培养基,例如LB。
同时,这种方法也适用于耐热的塑料,不少离心管、移液器、吸头、吸头盒都是可以通过高压来灭菌的。
使用高压灭菌需要注意2点:
1 将含有液体的玻璃器皿进行灭菌,如果其使用塑料盖密封,应在灭菌前拧松盖子,以防灭菌过程发生爆炸;
2 如果实验工具需要后续用于无菌操作实验,建议灭菌锅所用的水使用无菌的超纯水,因为灭菌过后,锅内有可能存在凝结水,而后者可能会存在污染带入的风险。
过滤除菌简介
对于不耐热的液体,可以使用孔径为0.1-0.2um的微孔过滤器除菌。
过滤的方法分为正压过滤和负压过滤,区别在于正压过滤大多通过外力推压针筒,使目标液体通过滤器的滤膜后,杂质或污染物留在膜上,液体过滤至新的容器内。
负压过滤是通过将容器外接一个泵,利用泵把容器内的空气抽走,实现一个负压的状态,而液体则从容器上方往下透过滤膜流入容器内。
使用过滤除菌,同样有几点要注意:
1 从操作上看,使用负压过滤会简单不少,但由于泵在抽走空气的同时,也会带走容器内的二氧化碳,因此过滤后的溶液所处的环境的pH会提高。
如果是一些对后续实验有pH要求的液体,应该视情况补充二氧化碳进容器内。
2 不管是正压还是负压,都需要对滤器进行质控检测,确保滤膜的完整性。这个质控操作有一个专有名词,叫起泡点试验。
具体操作是:当正压过滤完成后,所有液体已通过滤器时,提高压力直至滤器流出物中形成气泡,这就叫起泡点 (bubble point)。
它会在压力是过滤压力的两倍多时出现,过滤压力的数值可以参考产品说明书。
如果滤器在灭菌压力(100kPa)或更低压力时出现起泡,那么代表该滤膜已经穿孔。
在这种情况下,任何已经收集的滤出液都应该被认为是未灭菌的,需要重新过滤。同时应更换滤膜。
3 有一些化学溶液会溶解滤膜,因此,如果要使用过滤除菌的话,应该要提前检查滤膜材质是否能兼容这种化学溶液。
例如DMSO,不能使用PES材质的滤膜进行过滤。
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