实验原理:
Dot blot是一种半定量的蛋白质或核酸检测方法,其原理是将待测物直接滴于固相载体上,然后通过特异性抗体或探针与待测物结合,最终通过可视化方法来检测目标分子的存在与否。
溶液配置:
操作步骤:
(1)减取适当大小的PVDF膜,于甲醇活化1分钟。
(2)将活化后的PVDF膜于ddH2O中,在脱色摇床上清洗15分钟。
(3)提前预冷离心机,将样品在4℃低温条件下8000 rpm离心15分钟,取上清作为样品(分泌型蛋白)。
(4)取出活化后的PVDF膜在室温晾至半干,看见水膜消失即可。将收集的上清、空白对照、阳性对照分别取5 μl点样至PVDF膜上,风干。室温待样品吸收,样品吸收后点样处颜色加深。
(5)封闭:待PVDF膜上样品完全干燥后,于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭,37℃培养箱孵育2h或者4℃过夜孵育。
(6)TBST清洗PVDF膜5次,每次5分钟。
(7)一抗孵育:用含5%脱脂奶粉的TBST溶液以1:10000的稀释比稀释一抗,37℃培养箱孵育2h或4℃过夜孵育。
(8)TBST清洗PVDF膜5次,每次5分钟。
(9)二抗孵育:用含5%脱脂奶粉的TBST溶液以1:10000的稀释比稀释二抗,37℃培养箱孵育1.5 h。
(10)TBST清洗PVDF膜5次,每次5分钟。
(11)曝光:用滤纸吸干PVDF膜上的TBST溶液,滴加ECL超敏显色剂(A液:B液=1:1),提前将化学曝光仪预冷,进行曝光,观察并记录结果。
图1. Dot Bolt鉴定分泌型蛋白表达
注意事项:
(1)在整个操作过程中,手不能直接接触PVDF膜,以免蛋白污染或造成蛋白降解。
(2)脱脂奶粉封闭一定要充分,否则容易造成膜与蛋白的非特异性结合,膜上会出现杂点或假阳性,干扰试验结果。
(3)一抗浓度与二抗浓度不宜过高,否则容易造成高背景或者杂点。适宜浓度的选择,可以通过不同浓度组合的预试验进行确定。
(4)曝光时,时间的确定应该具体情况具体分析,需要一定的实践经验积累。
(5)ECL超敏发光液需要现配现用。
https://technologyinscience.blogspot.com/2019/06/dot-blot-technique-principle-procedure.html
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