在进行mIHC实验过程中，研究者可能会遇到各种问题，本文将详细探讨这些问题及其注意事项，帮助研究者顺利完成实验并获得可靠结果。
1. 一抗和二抗的选择及稀释
一抗和二抗的选择及其稀释浓度对实验结果至关重要。选择不当或稀释不准确会导致假阴性或假阳性结果。
注意事项：
先通过常规免疫组化优化并明确一抗、二抗的稀释比，再进行mIHC染色。mIHC染色的一抗浓度应小于常规免疫组化染色浓度。根据DAB显色时间进一步稀释一抗。例如，DAB显色时间为20-30秒，则一抗稀释比进一步稀释2倍。
2. 对照实验的重要性
缺乏对照实验会影响结果的准确性，无法证实抗体效价和检测系统的可靠性。
注意事项：
在每次染色过程中必须做对照实验，包括阳性组织对照、阴性组织对照和阴性试剂对照。对照实验能有效避免试剂失效或操作失当导致的假阴性和假阳性。
3. TSA荧光染料的选择
TSA荧光染料与抗原匹配不当会影响信号强度和结果的准确性。
注意事项：
丰度高的抗原匹配荧光强度弱的TSA染料，丰度低的抗原匹配荧光强度高的TSA染料。检测靶标有共定位关系时，尽量避免选用发射波长相邻的染料。
4. 多标染色顺序的确定
多标染色顺序不当会导致染色效果不佳。
注意事项：
如检测靶标在细胞中的定位不同，建议一抗染色顺序为胞膜、胞质、胞核。
5. 内源性过氧化氢酶的封闭
未能有效封闭内源性过氧化氢酶会导致非特异性着色。
注意事项：
3% H2O2可阻断组织中的内源性过氧化氢酶和碱性磷酸酶，减少由内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶造成的非特异性着色。封闭时间至少15分钟。
6. 抗原修复
抗原修复不充分会导致抗原暴露不足，从而影响抗原抗体的结合。
注意事项：
抗原修复液的选择和修复时间需根据预实验决定。常用的抗原修复液包括柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0）、EDTA修复液（pH9.0、pH8.0）。注意补加修复液，切忌干片，片子必须完全浸没于修复液中。
7. 封闭液和组化笔的使用
使用不当的封闭液和组化笔会导致非特异性染色。
注意事项：
使用正常羊血清封闭组织中的带电荷基团，避免与一抗的非特异性结合。画线前必须用吸水纸吸干水分！！避免组化笔上的油影响抗体覆盖组织。
8. 实验过程中的干片问题
实验过程中片子干燥会导致背景染色增加。
注意事项：
加入Tween-20的TBST缓冲液能更好地防止切片干燥。整个实验过程中切片不能干燥，但也不能残留太多缓冲液，以免稀释抗体浓度，造成假阴性结果。
9. 抗体的储存
抗体储存不当会导致抗体失效。
注意事项：
每次使用完抗体后，按照抗体说明书要求及时放回冰箱4℃或-20℃保存。
10. 二抗的选择
选择不当的二抗会影响染色效果。
注意事项：
二抗应与一抗来源配套。对于小鼠来源样本，应选择抗兔二抗；对于人源样本，可选择抗小鼠/兔二抗试剂盒。
11. 信号放大剂的使用
信号放大剂的浓度不当会影响结果。
注意事项：
信号放大剂中的H2O2浓度必须限定在一定范围内。通常稀释30% H2O2贮存液10,000-12,000倍，较为理想的终浓度为2-6 mmol/L。
多重荧光免疫组织化学技术通过其高灵敏度、多重标记和丰富的数据分析能力，为肿瘤微环境研究提供了强大的工具。虽然mIHC实验流程复杂，但其带来的科学发现和临床应用价值不容小觑。随着技术的不断进步，mIHC将在未来的肿瘤研究和个体化治疗中发挥越来越重要的作用。
感谢您的阅读，期待我们在科研探索的道路上共同前行！
本文作者是"林林"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：林林
校对：煲仔饭
素材：
https://images.app.goo.gl/6c2Hh8VHaqEd8Ts46
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