一、背景及原理
自1981年首次发现人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）以来，慢病毒的载体化研究迅速展开。慢病毒（Lentivirus）载体是通过对HIV-1进行改造而得到的，其采用了VSVG外壳，这使得慢病毒能够感染更多类型的细胞，包括分裂期和非分裂期细胞、干细胞以及原代培养的细胞。这种特性使得慢病毒能够在宿主细胞中实现较长期的外源基因表达，并且具有较高的安全性。因此，慢病毒成为了一种稳定表达外源基因、感染谱广泛的有效工具，在基因过表达、RNA干扰、miRNA研究等领域得到了广泛应用，为研究启动子调控、基因的过表达或者沉默等提供了有力支持。
其原理首先是将所需基因组整合到慢病毒载体中，然后将该载体转染至携带包装蛋白的细胞中。细胞内表达的包装蛋白能够与慢病毒载体结合，将外源基因组包装成慢病毒颗粒。最终，这些颗粒能够感染其他细胞，并释放外源基因组，实现基因传递和转移。
二、实验步骤
以贴壁细胞为例：
1）准备细胞
首先在24孔培养板中接种适量的目标细胞和平行对照293T细胞，确保它们处于对数生长期。由于不同细胞的生长速度不同，接种数量会有所不同，但一般会保证在第二天进行病毒感染时细胞的汇合率在30%-50%之间。然后将培养板放入37℃、5% CO2的培养箱中过夜培养。
2）感染病毒
对于-80℃冻存的病毒，将其在冰上融化后使用。接着将目标细胞取出培养箱，观察其生长状态，只有当细胞状态良好时（因为细胞状态会对转染产生影响），才能开始实验。
3）换液
通常，在添加病毒液后的24小时内，将含有病毒的培养液废弃，加入新鲜的完全培养液，并继续在培养箱中培养（具体换液时间可根据细胞感染后的状态进行调整）。如果感染后细胞出现明显的皱缩或状态不佳，建议在4-6小时内进行换液；如果感染后细胞状态一直良好，也可以延长换液时间至感染后48-72小时。
4）荧光观察/抗性药物筛选
在感染病毒48-72小时后，针对带有GFP报告基因的病毒，可使用荧光显微镜观察GFP荧光强度。对于携带Puromycin或其他抗性基因的病毒，可替换含有适当浓度抗生素的完全培养液进行筛选，以筛选出稳定表达的细胞株。
5) 稳定细胞株筛选
将Puromycin筛选后的细胞进行传代，并继续持续加入合适浓度Puromycin维持抗性，连续筛选并传3代后，冻存保存稳定表达细胞株。后续可通过Western blot或qPCR实验验证。
6）筛单克隆
在单克隆细胞培养中，首先将细胞均匀分布至96孔板，待其生长至80%融合后进行消化处理。随后，逐级将细胞传代至48、24、12、6孔板，最终过渡至6厘米培养皿，以确保单克隆的分离和纯化。然而，并非所有细胞都能成功生长，因此在实际操作中，通常需要一至两个月的时间才能取得期望的实验成果。
在接种后的几天里，每天都要观察细胞的生长情况。对于带有荧光标记的慢病毒，确保细胞株中的每个细胞都表现出100%的荧光，并进行适当标记。同时，定期更换培养液（含有抗生素），以维持培养环境的稳定。筛选结束后，与之前相同的步骤，对细胞进行qPCR或Western Blot鉴定。鉴定结果正常的单克隆细胞将被冻存保种，并进行复检。
三、注意事项
1）在进行病毒操作时，最好在生物安全柜内进行。如果只能使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风扇，以防止病毒扩散。在进行病毒操作时，请务必穿戴实验服、口罩和手套，以保护自己免受病毒的可能感染。
2) 慢病毒的储存条件及期限为：在-80摄氏度条件下可保存12个月，在4摄氏度条件下可保存一周。若需多次使用，建议将慢病毒分装后存放于-80摄氏度，并尽量避免反复冻融。反复冻融会导致病毒滴度下降，因此在使用过程中应尽量避免这种情况的发生。
3）细胞密度在慢病毒感染后的一段时间内可能会受到限制，因此通常建议将细胞密度设定为传代密度的1到2倍。然而，应避免使细胞融合度超过90%，以确保慢病毒的充分利用。
4）Polybrene在细胞培养中的主要作用是提高逆转录病毒感染细胞的效率。Puromycin的标准终浓度范围为1-10μg/mL，不同细胞系对Puromycin的工作浓度可能有所不同，可查阅文献或进行预实验以确定最佳Puromycin筛选浓度。
5）如果添加Puromycin后出现大量细胞死亡，需要及时换液，以防止死细胞释放的有害物质对具有抗性的细胞的生长产生不利影响。
本文作者是"小米"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：小米
校对：煲仔饭
素材：
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