siRNA转染后一定时间内，需采用基本方法验证其转染效率，常见验证方式包括Western blot、RT-PCR、流式细胞术及ELISA等，对于含有荧光的质粒，也可采用荧光显微镜直接观察的方式来大致确定转染效率。一般来说，由于转染后的细胞常用于功能学实验，因此应该选用可以确定其转染效率的方法，本文主要分享在mRNA水平或蛋白水平上验证基因沉默的效果。
收细胞时间由转染方式及细胞状态来决定，一般至少为转染后48h，上限一般为3-5天。
一、mRNA水平——RT-PCR验证
1.提取转染后的细胞的RNA并逆转录获取相应的cDNA后，配制SYBR、RNase-free water和cDNA的混合液，按照SYBR：RNase-free water为3：4的比例配制，cDNA按照一个孔（八连管）0.25μL配制。
2.引物配制：按照每孔上下游引物的混合物为1μL配制混合液。
3.将上述混合物离心并混匀，依次加入到八连管中，（1）中混合液每孔贴上壁加7μL,（2）中混合液每孔加1μL，并注意将目的引物与内参引物区分，避免上样时出错。
4.将八连管离心—震荡—再离心，使得引物与底物充分混匀，将离心好的八连管放至PCR仪，启动Bio-Rad CFX Manager程序。
RT-PCR结束后，保存曲线备用，并分析相应结果，绘制相应mRNA表达水平图比较转染效率，也可使用转染效率（%）=（1-2^-△△CT)*100%直接计算。
注意事项：
1.实验过程中必须戴口罩、手套，尽量避免其他人员干扰。
2.RT试剂盒从冰箱拿出，应该充分解冻，瞬离后混匀，放于冰上，可在冰上加样，避免反复冻融。试剂可以用数字贴纸编号，避免漏加、错加试剂。
3.取用不同的试剂时，必须更换枪头，样本之间要避免交叉污染。
4.反应体系配好之后，应充分混匀，瞬离，并且弹去管内的气泡。
5.每个样品至少3个平行孔，所有成份加完后，离心去除气泡。
6.如果目的基因表达量非常低，最多加入1μg TotalRNA，否则加入RNA量过高,可能会超出后续PCR的线性范围。
二、蛋白水平——WB验证
1.收集转染后的细胞提取蛋白并根据目的分子量大小选择配制适宜浓度的胶。
2.将变性后的蛋白液先震荡，再离心，可根据BCA测定的蛋白浓度上样；
3.根据日常经验进行电泳、转膜、封闭、敷抗体即可。
4.曝光条带保存备用，使用Image J计算灰度值，绘制蛋白水平图，分析转染效率。
注意事项：
1.背景脏，不规则成片背景，可能是封闭不充分，可以延长封闭时间或者更换封闭液。
2.条带上有黑色斑点，最常见的原因是封闭液没有完全溶解。
3.注意手不要触碰NC膜或是PVDF膜。
4.转膜液使用次数不宜过多，否则影响转膜效率。
三、验证注意事项
1.对于转染后的细胞，由于转染试剂毒性或敲减某基因可造成细胞状态不好或细胞数量较低，不管提蛋白或RNA，都应小心操作，避免细胞太少。
2.转染48h后可根据转染方式进行换液等操作，一般而言，对于敲减的细胞细胞一般会出现细胞变圆、细胞漂起来等现象，因此在选择收细胞天数时应多加注意，防止细胞死光，我个人而言，使用Lipofectamine RNAiMAX Reag转染最多可维持5-6天。
3.由于最终生物功能还是由蛋白决定，因此最终确定转染效率一般均需进行Western blot。
本文作者是"呜哇呜"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：呜哇呜
校对：煲仔饭
素材：Canva
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