今天研究分享的这篇文章名为“Aberrant R-loop–mediated immune evasion, cellular communication, and metabolic reprogramming affect cancer progression: a single-cell analysis”异常的 R 环介导的免疫逃避、细胞通讯和代谢重编程影响癌症进展:单细胞分析。于2021年1月在Molecular Cancer上发表IF为37.3，Q1区。
一、背景
这篇文章利用来自肺腺癌（LUAD）的单细胞RNA测序数据集，构建了一个R环评分模型，以表征与EGFR突变、组织起源和TNM分期相关的R环状态。R环是非B型DNA结构，由DNA-RNA杂交配对和置换的单链DNA（ssDNA）形成的三链结构。它可能干扰DNA复制、修复和转录，从而损害基因组完整性和功能。R环在哺乳动物基因组中普遍存在，参与多种生物过程，产生积极和消极的效应。生理性R环有助于DNA修复、细胞增殖和分化、RNA转录和加工，以及调节基因表达和DNA甲基化。此外，R环还在基因调控、端粒稳定、DNA复制和组蛋白修饰等方面发挥着重要作用。已有1000多种R环调节剂报道。研究发现，R环调节因子BRCA2的缺失可导致R环的异常积累，从而引发BRCA2缺陷细胞染色体异常。
二、介绍
本研究利用来自肺腺癌（LUAD）的单细胞RNA测序（RNA-seq）数据集，建立了一个R-loop评分模型，通过基于与EGFR突变、组织起源和TNM分期相关的已鉴定的R-loop调节因子来表征R-loop状态。研究的研究发现，R-loop评分可以反映肿瘤微环境特征，并预测抗肿瘤治疗效果。低R环评分与不良结局、抗癌治疗（如靶向治疗和化疗）的耐药性以及对免疫治疗无反应相关联。特别重要的是，研究揭示了由R环调节因子介导的R环分布变化对LUAD发展的因果关系。综上所述，研究的研究为利用靶向R环或R环调节剂改善癌症治疗临床反应提供了理论基础。
结果
恶性细胞的 R-loop 评分与 LUAD 的疾病结局相关
图1
为了探索R-loop与LUAD进展之间的关系，研究首先整合了两个独立的单细胞RNA-seq数据集（GSE123904和GSE131907）（图1A）。通过质量控制方法，研究从92,842个细胞中提取了26,248个RNA转录本，随后利用主成分分析（PCA）和UMAP方法获得了57个细胞簇。这些细胞簇已注释为10种已知的细胞类型，并区分了恶性细胞和潜在的非恶性细胞群。研究评估了整个转录组数据中的染色体拷贝数变异（CNV），结果显示恶性细胞和上皮细胞的上皮评分明显高于非恶性细胞，而恶性细胞在不同簇中被聚集到与其样本来源相对应的不同簇中，而非恶性细胞在患者之间没有表现出明显的差异（图1B-C）。
研究使用WGCNA筛选出与EGFR突变、组织起源和TNM分期相关的4个模块（图1D）。KEGG富集分析显示，这些来自四个模块的92个调节因子在DNA损伤/修复相关通路中显著富集（图1E）。基于这些鉴定基因的表达谱，研究构建了评分模型来表征R-loop状态。癌症转移样本的恶性细胞亚群（例如，亚群2、4、6、8和10）显示出低R环评分（图1F），而来自接受化疗的患者的恶性细胞具有明显较高的R-loop评分（图1G）。根据中位R-loop评分将恶性细胞分为R-loop评分高或低的组。两组在富集通路上均有显著差异，其中肿瘤进展相关信号通路主要富集在低分组（图1H）。
loop 评分表征肿瘤免疫逃逸表型
图2
鉴于免疫逃逸是免疫系统无法控制肿瘤进展的关键因素，研究的研究展示了在GEO数据集中恶性细胞免疫逃逸分子谱的变化（GSE123904和GSE131907）在具有高和低R-loop评分的亚组之间，以及两个不同评分亚组之间富集免疫原性细胞死亡（ICD）通路的评分差异（图2A）。结果显示，R-loop评分低的恶性细胞比R-loop评分高的恶性细胞更有可能逃避免疫反应，低分R-loop的CD4+和CD8+ T细胞以及NK细胞的耗竭评分显着增加（图2B-D）。
研究采用了单细胞RNA-seq数据（GSE146100）。通过降维聚类和标注后（见图2E），研究计算了每种细胞类型的R-loop评分（图2F），结果显示，恶性细胞的R-loop评分相当低，与其他细胞类型相比。抗PD-1免疫治疗有反应的患者的恶性细胞几乎完全聚集在高R-loop评分亚组中（图2G），这些患者恶性细胞的R-loop评分明显高于对这种治疗无反应的患者（图2H），这表明R-loop评分可以表征肿瘤免疫逃逸表型，并作为LUAD免疫治疗结果的预测因子。
R-loop重塑TME中的细胞间相互作用和细胞因子信号转导活性
由于细胞间相互作用是抗肿瘤疗效的关键因素，研究注释了 T 细胞亚型和巨噬细胞，使用单细胞 RNA-seq 数据集进行细胞通讯分析R-loop 评分与恶性细胞(如 CXCL16 和 CXCL2)的趋化因子水平显著呈正相关(图 3A)，高R-loop评分明显促进了恶性细胞产生的共刺激分子，包括TNFSF12、ICAM1和TNFRSF14(图3B)，同时，R-loop高分细胞中的共抑制信号明显降低(图3C)，恶性细胞与T细胞之间通过FAM3C和PDCD1、CD47和SIRPG以及LGALS9和CD47等共生分子的通讯增强，导致T细胞耗竭(图3D)。R-loop评分模式下的巨噬细胞对T细胞的共抑制和共刺激信号显示出不同的影响(图3E-F)。此外还展示了R-loop评分模式下恶性细胞-巨噬细胞通讯的差异。巨噬细胞可以与恶性细胞协同作用，激活R-loop评分低的T细胞，包括耗竭的T细胞和Treg细胞(图3G-H)。研究发现21 个细胞因子相关通路，在高 R 环评分的恶性细胞中被显着激活，并且 T 细胞和/或巨噬细胞中标记基因的水平呈正相关(图 3I)，高R环评分和低R环评分之间细胞因子信号通路(如GDF11、VEGFA和IL6)激活的差异有助于T细胞和/或巨噬细胞内的协同调节作用(图3J)。
R-loop 影响 LUAD 对 TKI 治疗的反应
图4
鉴于耐药性通过代谢重编程限制了TKI等药物的临床疗效，收集了一个单细胞数据集，接受 TKI 治疗的 LUAD 患者的 49 个组织样本。获得几个细胞簇，并分别注释为6种细胞类型(图4A)，对TN(开始靶向治疗之前)、RD(完全或部分响应状态)和PD(疾病进展状态)亚组细胞簇分布的分析显示，恶性细胞对TKI具有显著的高度特异性，并且在PD亚组中显著富集(图4B-C),根据92个R环调节因子的表达谱计算恶性细胞的R环评分。R-loop评分低的恶性细胞主要来自PD样本(图4D)，根据恶性细胞的R-loop评分患者分为两个亚组，评分高的患者在生存率方面具有显著优势(图4E)，转移性和晚期肿瘤的R环评分明显较低，RD患者的R环评分显著升高(图4F)。根据R-loop评分和TKI等分层因素分别进行GSEA。炎症反应通路和免疫相关通路在R环评分高的RD样本中明显富集，而代谢相关通路在R环评分低的RD样本中显著富集(图4G),对代谢相关通路进行GSVA，负责肿瘤进展的能量代谢途径在具有低 R 环评分的样品中显着富集(图4H)，能量代谢相关基因在R-loop评分低的样品中上调，其表达与R-loop评分呈负相关(图4I)。
R-loop评分与所有癌症的预后密切相关
R环在肿瘤进展中起着重要作用，研究评估了R环模式的预后，与 R-loop 评分相关的风险比 (HR) 曲线，发现 R-loop 评分在 LUAD 的 7 个独立队列中高分组的结局明显优于低分组(图5A)，并结合临床因素进行 Cox 比例风险模型的风险比线，R 环评分小于中位值时，Ln (HR) 区域的 95% 置信区间 (CI) 低于参考线，反之亦然(图5B)。此外，研究评估了来自 TCGA 数据集的 33 种肿瘤类型的的R环评分分布相似(图5C)，根据每种肿瘤类型的R-loop评分的中位数分为高分和低分亚组，与正常组织相比，肿瘤样本的 R-loop 评分显着降低(图5D)，此外，单因素和多因素生存分析进一步表明，低分组在几乎所有肿瘤类型中都与不良结局一致(图5E)。
R-loop 评分可预测治疗预后和治疗反应
为探索R-loop评分模型预测癌症患者治疗效果的能力，提取了32个肿瘤RNA-seq数据集，根据 R-loop 评分的临界值将患者分为两个不同的评分亚组。在六个独立队列中，两个亚组之间的生存概率存在显著差异(图6A)，通过分析不同程度化疗反应的患者之间R环评分的差异来评估研究模型的性能，R-loop 评分在五个队列中表现出良好的分类性能(图6B)，还评估了R-loop评分模型在接受靶向治疗的患者中的预测性能、高分组结局明显优于低分组(图6C)。此外，RD组在五个队列中的得分始终高于其他反应型组(图6D)，研究观察到高 R-loop 评分亚型接受免疫治疗的患者预后明显优于低分组患者（图6E）。值得注意的是，在这五个队列中，RD 组的 R-loop 评分显著高于 NR 组或 PD 组（图6F）。此外，研究对免疫治疗 R-loop 评分模型进行了验证，在六种肿瘤类型的 16 个依赖数据集中观察到了曲线下面积值（图6G）。综合而言，研究认为 R-loop 评分可能是肿瘤治疗效果的有效预测因子。
FANCI 影响 R 环分布，导致 LUAD 肿瘤进展
图7
研究绘制 LUAD 细胞的 R 环图，发现启动子区域峰处的reads数量高于其他区域(图7A)，R-loop峰一半的峰位于基因间区，而11。57%位于启动子和终止子区(图7B)，FANCI是一种R环调节因子，在所有的肿瘤类型中均上调，其高表达与不良预后相关(图7C)，研究测试了FANCI缺乏对R-loop分布的影响(图7D)，而且FANCI敲除明显改变了R-loop的格局，显示出强烈的损失趋势(图7E)，研究分析了R环峰数量的差异(图7F)，在其他类型的基因区域中都观察到这种变化，此外，具有R-loop变化的基因在癌症进展相关通路中显着富集，例如Ras和MAPK信号通路(图7G)。FANCI 可能通过调节 R 环参与 LUAD 进展，进一步检测了Ras信号通路的活性，发现沉默 FANCI 明显减弱了Ras的活性，导致其下游PI3K/AKT/NF-κB和MAPK/ERK 信号级联在 LUAD 细胞中被强烈抑制(图7H-I)。
图8
最后，细胞功能实验表明，FANCI耗竭显著抑制了PC-9和A549细胞的细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力，并促进了细胞凋亡(图8A-F)。异种移植研究表明，FANCI沉默限制了PC-9细胞在体内形成肿瘤的能力(图8G)。
结论
综上所述，低分R环的分布模式与T细胞耗竭相关，可能促进肿瘤的进展，并提供了有关低分R环分布下免疫逃逸和代谢重编程导致药物耐受机制的见解。研究结果有助于加深对R环分布与代谢异质性和TME重塑之间关系的理解。此外，研究进一步突出了异常R环在癌症发展中的因果作用，为设计个体化治疗策略提供了重要参考，并有望推动在R-loop或R-loop调节剂基础上开发更有效的LUAD治疗方案。
【参考文献】
Zhang S, Liu Y, Sun Y, Liu Q, Gu Y, Huang Y, Zeng Z, Tang F, Ouyang Y. Aberrant R-loop-mediated immune evasion, cellular communication, and metabolic reprogramming affect cancer progression: a single-cell analysis. Mol Cancer. 2024 Jan 10;23(1):11. doi: 10.1186/s12943-023-01924-6
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