上回我们综述了CAR-T治疗的原理，对比了CAR-αβT和CAR-γδT治疗的优势和局限性，以及在临床试验中的研究进展，其中提到了CRS（细胞因子释放综合征）和免疫抑制性肿瘤微环境等原因限制了CAR-T疗法的有效性和安全性（具体请阅读：CAR-T的T需要passion）。为了解决这些问题，研究人员已经研究出了CAR-NK、CAR-NKT、CAR-M等CAR-免疫治疗，这些疗法使用的都是先天性免疫细胞，安装上CAR后，可以通过抗原依赖性和抗原非依赖性途径杀伤肿瘤细胞，为提高免疫治疗疗效和减轻毒副作用带来了希望。
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NK细胞是先天免疫系统中的一种淋巴细胞，具有产生大量的炎性细胞因子和快速而强大的细胞毒作用，可以在没有事先致敏的情况下靶向和杀死癌细胞（即为先天免疫）。
NK细胞识别癌细胞的机制：“缺失自我”、“诱导自我”和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
①肿瘤细胞表面的MHC-I经常缺乏或低表达，可触发NK诱导的杀伤，称为“缺失自我”识别。
②NK细胞可以识别应激细胞表面上调的配体，称为“诱导自我”识别。
③抗体依赖性细胞毒性(ADCC)：NK细胞可以通过CD16 (FCγRIII)介导IgG调理的细胞毒作用，FCγRIII与IgG抗体的FC部分结合并诱导细胞毒性。
NK细胞杀伤癌细胞的机制：首先通过形成溶解性免疫突触来消灭靶细胞，并分泌含有颗粒酶B和穿孔素的细胞溶解颗粒，导致靶细胞凋亡；然后通过死亡受体，如Fas配体和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL），诱导靶细胞死亡。此外，NK细胞可以产生多种促炎细胞因子，包括IFN-γ和TNF-α，以限制靶细胞的生长并协调其他先天和适应性免疫细胞的功能。
T细胞的CAR结构可以用于NK细胞（图1）。
①第一代：具有单个 CD3ζ 信号结构域，通常需要额外的共刺激信号才能获得强大的细胞毒性反应。
②第二代：CAR 通过将单个共刺激结构域（如 CD28、CD137 （4-1BB） 或 CD134 （OX40））与 CD3ζ 联合来解决这个问题。
③第三代：CAR通过结合两个与CD3ζ融合的共刺激结构域进一步增强了活化和持久性。
④第四代：利用合成生物学来增强功能和安全性，这些包括整合用于自分泌激活的细胞因子基因和诱导型半胱天冬酶9系统作为管理效应细胞毒性的安全开关。
目前为了提高CAR-NK抗肿瘤的潜力，CAR-NK结构仍然在不断进行优化，比如将一种靶向NK细胞特异性抑制受体的抑制性CAR(iCAR)引入NK细胞，防止NK细胞相互攻击，以提高CAR-NK细胞的活性和寿命。
CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞的潜在优势包括：
①与T细胞不同，NK细胞与降低GVHD 风险有关，因为NK细胞以HLA不受限制的方式发挥作用，即不需要供体和受体之间的完美匹配。这使得NK细胞成为同种异体细胞治疗的选择。
②NK细胞产生的促炎细胞因子水平低于T细胞，这降低了严重CRS的风险，CRS是一种全身性疾病，在最严重的病例中表现为全身症状、发热、低血压和器官功能障碍，它由细胞因子的大量释放引发，IL-1 和 IL-6、CAR-T 细胞和TME在癌细胞识别后起着关键的致病作用。
③NK细胞具有抗原依赖性和抗原非依赖性方式（天然的细胞毒作用）识别和消除癌细胞。
④NK细胞识别并杀死具有下调MHC I类分子的细胞，这是癌细胞逃避T细胞检测的常见机制。
⑤CAR-NK细胞在早期临床试验中证明了安全性和潜在疗效，有望用于治疗实体瘤，包括胃肠道癌。
CAR-NK细胞的首次大规模试验结果表明，它们在CD19+慢性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤患者中的安全性和强大的临床活性（NCT03056339）。如前所述，CAR-NK细胞作为癌症免疫治疗方案比CAR-T细胞具有多项优势。然而，CAR-NK细胞疗法也面临挑战，例如靶抗原丢失、肿瘤异质性、肿瘤免疫抑制微环境和CAR-NK细胞的持久性。因此，能最大限度地提高CAR-NK细胞疗法疗效的策略至关重要。
①CAR-NK细胞的靶抗原：CAR-NK细胞具有通过CAR依赖性途径和天然机制（ADCC）对癌细胞发挥细胞毒作用的独特能力，因此可以改变CAR的设计，利用NK细胞的天然细胞毒性途径，从而降低对可能表达靶抗原的正常细胞造成损伤的风险。例如，可以设计缺乏共刺激结构域的CAR，使CAR-NK细胞主要利用其先天性细胞毒性能力，同时最大限度地减少CAR诱导的直接细胞毒性。此外，NK细胞可以被修饰为携带非激活的CAR，该CAR不会直接触发细胞毒性，而是增强NK细胞的靶向、粘附和向癌细胞的迁移。这种方法能够靶向更广泛的抗原，包括HER2、EGFR和间皮素。
②肿瘤异质性：理想的靶标应在癌细胞上高表达，在正常组织中表达最少或没有表达。这种特异性对于降低脱靶效应和相关毒性的风险至关重要。所以可以鉴定一组最优的靶标，也可以开发多靶点CAR-NK细胞。
③肿瘤免疫抑制微环境：TME包含各种免疫抑制因子，包括缺氧、TGF-β、PGE-2以及阻碍免疫细胞活性的细胞外代谢物（如乳酸和腺苷），这些显著阻碍了免疫细胞对肿瘤的破坏。因此，可以修饰NK细胞以抵抗这些抑制因子，例如，降低NK细胞上TGF-β受体II的表达已被证明可以部分抵消TME的负面影响，而不会影响抗白血病疗效。
④CAR-NK细胞的持久性：CAR-NK细胞寿命较短，往往仅持续1-2周，在没有细胞因子支持的情况下，它们的疗效受到了极大的限制，而外源性细胞因子可能会引发副作用并激活其他免疫细胞，例如调节性T细胞，从而损害NK细胞的功能。应用基因工程技术，使NK细胞不仅携带CAR，还携带细胞因子、抗体和蛋白酶等激活剂，以促进其生长、运动和肿瘤渗透。例如，IL-15在NK细胞发育、存活和活化中起着至关重要的作用，表达IL-15的CAR-NK细胞在体内表现出增强的持久性和抗肿瘤活性。
目前CAR-NK已经在血液系统肿瘤和实体瘤中显示出了可喜的疗效，包括急性髓系白血病、淋巴瘤、肝细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、食管鳞状细胞癌等。
例如，在胃癌中，HER2蛋白显著过表达，研究人员设计了HER2-CAR-NK细胞，特异性靶向并破坏HER2阳性胃癌细胞，并产生更高水平的细胞因子。但是HER2-CAR-NK细胞在较大的实体瘤中的疗效降低，深入研究表明，阿帕替尼治疗可使NK细胞浸润到更大的肿瘤中，从而提高HER2-CAR-NK细胞的治疗效果。这种方法提出了一种通过将药物治疗与免疫细胞疗法相结合来治疗大肿瘤或耐药性肿瘤的新策略，以改善整体治疗结果。
巨噬细胞是主要的先天免疫细胞（激活先天性免疫），具有强大的吞噬能力、抗原呈递活性、分泌细胞因子和趋化因子，以及穿透致密组织并在肿瘤中积累等多种特性。 这些属性使巨噬细胞成为CAR免疫治疗的潜在候选者。肿瘤相关巨噬细胞TAM有两种类型，分别为M1和M2。
①M1巨噬细胞为抗肿瘤亚群，因为它们在吞噬癌细胞后释放促炎因子和趋化因子，表现出抗原信号以激活CD4+T细胞和细胞毒性CD8+T细胞，从而激活机体免疫。并且M1巨噬细胞产生肿瘤杀伤分子，包括活性氧（ROS）和有毒一氧化氮（NO），对肿瘤细胞产生直接的细胞毒作用。
②M2巨噬细胞为促肿瘤亚群，可以产生IL-10、IL-4 和转化生长因子-β（TGF-β）等抗炎细胞因子，高表达精氨酸酶1（Arg1）可以介导多胺合成和胶原蛋白形成，以及刺激肿瘤细胞生长和修复受损组织，它们还分泌血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶（MMP）以促进肿瘤侵袭和转移。
基于以上对巨噬细胞的介绍，研究人员对巨噬细胞进行重编程，使得TAM的表型从促肿瘤表型转变为抗肿瘤表型（即M2重编程为M1）。可以有两种策略：
①针对巨噬细胞极化信号通路：使用TLR激动剂、CSF1-R抑制剂、PI3K抑制剂和某些表观遗传学抑制剂。
②针对特定的TAM功能：通过靶向SIRP1α-CD47、LILRB1-β2M、Siglec10-CD24和PD1-PDL1等增强吞噬作用，还可以通过抑制Siglec1、PD-L1、MARCO 和LILRB2来靶向巨噬细胞免疫抑制活性。
重编程使巨噬细胞维持在M1表型，促进促炎细胞因子和ROS的分泌，吞噬能力的提高和巨噬细胞介导的CD8+T细胞、NK细胞和中性粒细胞的免疫功能的增强。
基于以上认识，CAR-M的机制就是使巨噬细胞维持在M1抗肿瘤的状态（目前临床上CAR-M的细胞来源通常是外周血单核细胞和诱导多能干细胞），CAR-M通过释放 TNF、NO 和 ROS 介导直接细胞毒作用（图4a），也通过其表面的FcR与肿瘤细胞上包被的抗原肽结合来发挥ADCC和抗体依赖的吞噬作用ADP(图4b)。当 CAR-M 将肿瘤抗原呈递给辅助性 T 细胞并募集其他免疫细胞时，可以实现协同免疫反应(图4c)。并且CAR-M可以根据CAR的设计发挥不同的作用，比如CCL19-CAR-M促进 CCR7 阳性肿瘤细胞的吞噬，从而减缓肿瘤进展和转移；CD147-CAR-M触发 MMP产生以降解ECM，并促进更多的免疫细胞浸润（图4d）。
目前对CAR-M的设计结果表明，CAR-T的设计原则也适用于CAR-M，而细胞内结构域通常被修饰为包含促进巨噬细胞活化和极化的信号转导基序。
①第一代CAR-M（图5a、b和c）：
a. 将CD3ζ作为细胞内结构域可以促进CAR-M的能力。
b.细胞内结构域Megf10显著增强吞噬作用，并且PI3K的加入进一步促进了吞噬能力。
c. 细胞内CD147信号导致ECM降解，从而将更多的T细胞募集到TME。
②第二代CAR-M（图5d、e和f）：
d. 利用腺病毒载体Ad5f35将抗HER2-CAR转移到巨噬细胞中，使巨噬细胞向M1表型倾斜。
e. 诱导多能干细胞IPSC分化的巨噬细胞为CAR-M提供了充足的来源。表达CD86-FcRγ-CAR的巨噬细胞的抗肿瘤活性显著增强，f. 表达CD3ζ-TIR-CAR的巨噬细胞可以维持长期的M1极化。
③第三代CAR-M（图5g和h）：
g. 通过CAR-IFN-γ纳米复合物将IFN-γ添加到细胞内结构域，显着增强抗肿瘤疗效。
h. 携带RP-182肽的纳米复合物不仅将巨噬细胞表型促进到M1，而且还将CAR-ErbB2基因递送给巨噬细胞，从而改善其吞噬作用。
在这里研究人员比较了CAR-T、CAR-NK和CAR-M的优势和面临的问题（图6）。CAR-T面临的GVHD和CRS、神经毒性等副作用，而CAR-NK和CAR-M疗法大大减少，部分是因为NK细胞和巨噬细胞是先天免疫细胞，安装上CAR之后，具有抗原依赖性和自身天然的细胞毒作用来发挥抗肿瘤的作用，多重杀伤机制使得CAR-NK和CAR-M的毒副作用降低；细胞的扩增问题和缺乏肿瘤特异性抗原是三种疗法均面临的问题，这提示探索最优的靶标（在癌细胞上高表达，而在正常细胞上低表达或不表达）对未来提高治疗疗效，减少毒副作用是至关重要的，这也符合精准医疗的准则。
①大量浸润肿瘤组织的能力：细胞外基质（ECM）由多种大分子蛋白、纤维分子、蛋白多糖、糖蛋白和糖胺聚糖组成，是大多数抗肿瘤治疗（包括 CAR-T 和 CAR-NK 治疗）的物理屏障。相比之下，巨噬细胞能够通过分泌多种参与细胞外基质降解的基质金属蛋白酶（MMP）来浸润TME。
②很少发生重度CRS和神经毒性。
③提高了抗原提呈的能力并促进了T细胞的细胞毒性作用（激活适应性免疫反应），有更强的吞噬活性和肿瘤杀伤能力。
④具有可靠的细胞来源和扩展扩增：目前临床上CAR-M的细胞来源通常是外周血单核细胞和诱导多能干细胞。
⑤降低了靶标特异性非肿瘤毒性：这是由于CAR表达的瞬时性质。
①高插入突变风险：CAR-M基因转移主要通过病毒转染进行，插入突变风险提高。
②缺乏肿瘤特异性抗原（这是CAR-T、CAR-NK、CAR-M均面临的挑战）
③静脉输入的巨噬细胞在体内的迁移特性会严重影响治疗效果。
研究人员发现CAR-M和CAR-T可以在体外协同杀死肿瘤细胞。CAR-T细胞分泌的细胞因子，如IFN-γ和GM-CSF，可以将巨噬细胞转化为M1表型，从而增强CAR-M的细胞毒性。同时，这些细胞因子可以触发CAR-M上CD80或CD86的上调，这反过来又可能通过CD28正向调节CAR-T细胞的细胞毒能力。此外，当CAR-T和CAR-M共培养时，IFN-γ、IL-1β、CXCL1、MIP-2、IL-6和单核细胞趋化蛋白（MCP）-1等细胞因子的水平急剧增加，可能在体内形成炎症TME。CAR-T和CAR-M的协同效应表明联合治疗癌症治疗的可行性。此外，CAR-M的肿瘤浸润能力可能会将更多的CAR-T细胞募集到肿瘤部位，并发挥强大的肿瘤杀伤能力。
NKT细胞称为自然杀伤T细胞，其细胞表面同时表达T细胞受体TCR和NK细胞受体。NKT细胞能大量产生细胞因子，且可以发挥与NK细胞相似的细胞毒作用（这里我们应该想到CAR-NKT的CRS和神经毒性也是大大降低的），即NKT细胞可以调节先天性免疫和特异性免疫。
CAR-γδT 和CAR-NKT细胞都可以通过 CAR-、ADCC-、Fas/FasL-、TRAIL 和 TNFR 介导的方式杀死肿瘤细胞，并可以通过分泌细胞因子来动员其他免疫细胞。CAR-γδT 细胞也可以被选定的受体激活，而 CAR-NKT 细胞的激活受体仅限于CD1d。此外，CAR-γδT 细胞可以将抗原呈递给 T 细胞，CAR-NKT 细胞可以促进树突状细胞成熟并被树突状细胞激活。
CAR-NKT细胞疗法由于其NK细胞和T细胞双重特性的优势，可以弥补CAR-T细胞疗法的缺点。
①CRS减少：与传统的CAR-T细胞疗法相比，CAR-NKT细胞疗法具有与CAR-T细胞相当的肿瘤细胞毒性，但CRS等副作用明显减少。
②多种机制杀伤肿瘤细胞：CAR-NKT细胞可以通过CAR和CD1d依赖性机制双重特异性杀伤能力（NKT细胞杀伤依赖于靶细胞CD1d的表达，因此NKT对CD1d阴性肿瘤细胞无效；但是，将其与CAR结合使用可以弥补这一限制）；也可以通过FASL、TNF-α、TRAIL和穿孔素/颗粒酶以靶点非依赖性方式直接杀死肿瘤细胞，这使得它们更适用于消除异质性肿瘤。
③改善肿瘤微环境：CAR-NKT细胞可以通过启动Th1/Th2细胞因子级联反应来募集和激活其他免疫细胞，包括激活NK细胞和成熟的树突状细胞以刺激细胞毒性T淋巴细胞并抑制TAM。
④不会诱导GvHD：NKT细胞识别CD1d，一种非经典的MHC-I样分子，因此，CAR-NKT细胞疗法不会诱导GvHD。
4、CAR-NKT面临的挑战及解决方案
①与CAR-γδT一样，面临数量少、扩增困难的问题。研究人员发现，将iNKT TCR基因工程化为造血干细胞（HSC），以生成工程化iNKT细胞。这些HSC-iNKT细胞与内源性iNKT细胞非常相似，在体内有效抑制多发性骨髓瘤和黑色素瘤异种移植物的生长。
②持久性差。CAR-NKT细胞注入体内后活性和增殖逐渐下降，需要多次输注CAR-NKT细胞才能达到预期的治疗效果，这加剧了NKT细胞数量少的问题。有研究表明CD62L NKT细胞在小鼠模型中具有更好的持久性和抗肿瘤活性。
到目前为止，只注册了5项CAR-NKT临床试验。其中，靶向GD2的自体CAR-NKT细胞用于治疗复发或耐药性神经母细胞瘤的I期临床试验结果（NCT03294954）显示：通过逆转录病毒转导从3例患者的外周血单个核细胞中产生CAR-NKT细胞，并分别扩增了15、14和9天，分泌IL-15的CAR-NKT细胞输注患者后在体内扩增，有效浸润肿瘤部位，介导肿瘤消退。3例患者中有1例达到CR，骨转移消退，无患者出现明显的副作用。这项研究表明，尽管NKT细胞在外周血中很少见，但可以进行基因修饰以表达CAR，在临床规模上扩增，并安全地用于治疗患者。
不同于T细胞，NK细胞、巨噬细胞、NKT细胞都是先天性免疫细胞，本身都具有先天的细胞毒作用，可以在事先没有致敏的情况下迅速作出反应。这些细胞安装上CAR结构之后，就拥有了抗原依赖性和本身的细胞毒作用两种杀伤肿瘤的机制，研究人员重新设计CAR结构，可以最大程度的降低CAR引发的毒副作用，同时最大程度的激发这些细胞本身的天然抗肿瘤作用，这样就做到了提高疗效的同时减少了毒副作用。但是细胞数量少、扩增困难、缺乏特异性抗原是CAR免疫疗法共同面临的问题，这也指给了我们未来的研究方向，解决这些问题，CAR-免疫疗法将更上一层楼。
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