还在苦恼孟德尔随机的文章难发表？那是因为没有掌握正确升级通关的方法，今天就来看看一篇结合孟德尔随机的纯生信文章，仅用5张图就一键毕业。幼稚 CD4+ T 细胞及其分化的对应细胞在肿瘤免疫微环境中发挥着重要的调节作用，但它们对肺腺癌（LUAD）的影响尚未完全明了。研究利用孟德尔随机法（MR）评估了幼稚CD4+ T细胞与LUAD之间的因果关系，采用改进的单样本基因组富集分析（ssGSEA）算法和癌症基因组图谱（TCGA）数据库，确定了幼稚CD4+ T细胞的浸润水平及其分化亚型，并研究了它们与临床特征的相关性。通过Mantel检验和京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库富集分析，确定了T辅助细胞的潜在调控途径。
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一、研究背景：
LUAD是非小细胞肺癌中最常见的亚型，其进展受多种因素的影响，尤其是肿瘤免疫微环境。在对肿瘤免疫微环境的研究中，一部分集中在幼稚 CD4+ T 细胞及其分化亚型的调节功能上。肿瘤免疫微环境是肿瘤周围的一个动态系统，其特点是由多种细胞类型、信号分子和细胞因子相互作用组成的复杂网络。包括幼稚 CD4+ T 细胞在内的免疫细胞分化成各种亚群和亚型，显示出广泛的多样性和错综复杂的关系。特定免疫细胞类型的功能结果会受到周围环境中存在的其他细胞或调节因子的显著影响。因此，研究免疫细胞及其群体在肿瘤微环境中的作用对肿瘤治疗大有裨益。
在人体组织中，幼稚 CD4+ T 细胞代表了未受抗原刺激的潜在免疫反应细胞，在启动和调节免疫反应中发挥作用。通过特异性 T 细胞受体[12]激活后，幼稚 CD4+ T 细胞可分化成各种亚群，如辅助性 T 细胞 1 型（Th1）、辅助性 T 细胞 2 型（Th2）、辅助性 T 细胞 17 型（Th17）、调节性 T 细胞（Treg）和滤泡辅助性 T 细胞（Tfh）。鉴于幼稚 CD4+ T 细胞及其分化亚群在肿瘤中作用的不确定性，采用适当的验证方法阐明它们在 LUAD 中的作用将大大有利于肿瘤免疫疗法策略的制定。
全基因组关联研究（GWAS）数据库是进行MR分析的重要工具，它整合了先前GWAS研究对单核苷酸多态性（SNP）暴露和结果的总结估计。MR可以估计暴露对结果的因果效应，并能有效减轻混杂变量的影响，减少实验结果的偏差。此外，这种方法还能确保实验组和对照组在初始阶段拥有相似的特征和潜在因素，从而使实验结束时观察到的差异更有可能归因于治疗效果而非其他外部影响。Mantel检验是一种易于实施且灵活的方法，用于检验两个距离矩阵之间的相关性。本研究旨在采用MR和观察性研究相结合的方法，调查幼稚CD4+ T细胞及其分化亚型在LUAD中的作用，寻找导致这些结果的潜在原因。
二、主要结果
1. 幼稚 CD4+ T 细胞对 LUAD 有保护作用
采用逆方差加权（IVW）法筛选了 336 种 T 细胞表型，确定了 12 种 T 细胞亚型（图 1A）。这 12 个 T 细胞亚型来自两种性状类型：中位荧光强度（MFI，8 个）和 相对细胞数（RC，4 个）， 计算结果汇总于表 1。应用假发现率（FDR）方法校正原始 p 值，只有幼稚 CD4+ T 细胞上的 CD4 显示出显著差异，图 1B 中的森林图显示了五种计算方法的结果。IVW和加权中位数等主要算法显示出显著差异，且HRs一致，表明CD4对LUAD上的幼稚CD4+T细胞有抑制作用。虽然MR Egger、简单模式和加权模式等次级算法未显示出显著差异，但它们的HR<1.00表明CD4对LUAD上的幼稚CD4+T细胞有抑制作用的趋势。
随后，采用 TCGA 数据库中的 LUAD mRNA 数据验证了MR的结果，结合 CellMarker 数据库，LUAD 中不同浸润水平的幼稚 CD4+ T 细胞表现出显著差异，并显示出肿瘤抑制作用（图 2）。然而，由于幼稚 CD4+ T 细胞未接触过抗原，免疫记忆能力较弱，也未经历过免疫反应，因此分析其特定亚型在 LUAD 中的作用具有实际意义。由于 GWAS 中没有关于幼稚 CD4+ T 细胞分化的数据，遂使用 TCGA 数据库探讨相关细胞在 LUAD 中的作用。
2. 幼稚 CD4+ T 细胞分化的亚型对 LUAD 有双重影响
采用 ssGSEA 算法计算了每个样本中 Th1、Th2、Th17、Treg 和 Tfh的浸润得分，为了研究这五种细胞类型与临床特征之间的关系，首先从四个时间维度进行了分析：总生存率(OS)、疾病特异性生存率(DSS)、无病生存率(DFS)、无进展生存率(PFS)（图 3）。当OS作为主要研究终点时，单变量 Cox 回归分析显示 Th2 对 LUAD 有显著的促进作用（图 3A）。同样，以 DFS 或 PFS 作为研究终点时， Th2 对 LUAD 有显著的促进作用（图 3C、D）。然而，当以 DSS 作为主要研究终点时，结果显示 Treg 对 LUAD 有明显的抑制作用（图3B）。
进一步研究了临床分期、TNM、Th2和Treg之间的关系，但没有发现统计学上的显著差异。为了了解这些观察结果背后的原因，对样本进行了 GSEA 信号通路富集分析（图4）。使用浸润评分中位数对 Th2 和 Treg 的不同浸润水平进行分类，然后进行 GSEA，结果根据归一化富集分（NES）进行排序。对高水平 Th2 浸润的分析显示，168 个基因在 Ub-特异性加工蛋白酶通路中富集（图 4A）。Ub-特异性加工蛋白酶（USP）参与了 MDM2、MDM4、TP53 和 FOXO4 等肿瘤蛋白的去泛素化过程。这四个基因与 Th2 细胞浸润水平的相关性分析表明，Th2 细胞与 MDM2 有很强的相关性（图 4B），而其余三个基因没有统计学差异。这表明 Th2 细胞浸润的增加可能会影响 MDM2 的去泛素化。
对高水平 Treg 细胞浸润的分析表明，473 个基因在中性粒细胞脱颗粒中富集（图 4C）。中性粒细胞脱颗粒是中性粒细胞反应的重要组成部分，研究表明它参与了肿瘤杀伤过程。然而，这一过程需要转录因子 BATF3、cDC1（活化的树突状细胞）、CD8+ T 细胞以及转录调节因子和肿瘤抑制因子 IRF1 的参与。相关性分析表明，Treg 细胞浸润与cDC1密切相关，其次是 IRF1、活化 CD8+ T 细胞和转录因子 BATF3（图 4D）。这表明，Treg 细胞浸润的增加可能会增强中性粒细胞清除肿瘤的反应。
3. 采用 CD4 标记幼稚 CD4+ T 细胞分化的细胞亚型
为了研究从幼稚 CD4+ T 细胞分化而来的 T 辅助细胞亚型对 LUAD 的影响，使用 Mantel检验评估了这些亚型与细胞标记物之间的相关性。T 辅助细胞组（Th1、Th2、Th17、Treg 和 Tfh）与 CD4 具有强相关性，其次是 CD3E、CD3D、CCR4、CXCR3、GATA3、CCR6、GP1BA和 IL4（图 5 A）。因此，使用 CD4 来识别 T 辅助细胞群，用CD4 表达水平代替 T 辅助细胞浸润，以进一步研究它们在 LUAD 中的作用。
图5 CD4 标记的 T 辅助细胞群在 LUAD 中的作用
T 辅助细胞对 LUAD 具有双向调节作用，根据中位表达水平，CD4 标记的细胞被分为高组和低组。当 OS 作为主要终点时，CD4 标记的 T 辅助细胞对 LUAD 有促进作用（图 5B）。随后对 CD4 标记的 T 辅助细胞进行了 GSEA，发现473 个基因富集于中性粒细胞脱颗粒过程中，323 个基因富集于MAPK 家族信号通路中，以及259 个基因富集于血小板活化、信号传导和聚集中（图 5C）。
为了验证这些途径对LUAD的影响，分析了CD4标记的T辅助细胞与关键调控基因或细胞之间的相关性。在参与中性粒细胞介导的肿瘤根除的四个关键调控基因或细胞中，CD4 标记的 T 辅助细胞与cDC1表现出很强的相关性，其次是 IRF1、活化的 CD8+ T 细胞和转录因子 BATF3，这表明 T 辅助细胞浸润的增加可能会增强中性粒细胞清除肿瘤的效应（图 5D）。同样，在参与MAPK家族信号通路的两个关键调控基因中，CD4标记的T辅助细胞与MAPK1呈轻度相关，其次是MAP2K1（图5E），表明T辅助细胞可能通过上调MAPK家族信号通路促进LUAD的发生。在与血小板活化、信号传导和聚集相关的两个关键调控基因或细胞中，CD4标记的T辅助细胞与血小板表现出高度相关性，其次是启动血小板活化的关键基因GP1BA（图5F），这表明T辅助细胞可能会增强血小板的活化和粘附过程，从而促进LUAD的发展。
三、总结
幼稚 CD4+ T 细胞及其分化亚型在 LUAD 中的调节作用是复杂的，并表现出明显的双向作用。除了存在促进癌症形成的信号通路外，还存在阻止肿瘤生长的活跃信号通路。开发新型细胞分化诱导剂，增强肿瘤部位的抗癌信号通路，逆转潜在的致癌调控过程，有望为癌症治疗带来潜在的益处。
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参考文献
Liu, R., Yang, G., Guo, H. et al. Roles of naïve CD4+ T cells and their differentiated subtypes in lung adenocarcinoma and underlying potential regulatory pathways. J Transl Med 22, 781 (2024).
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