乳酸+组蛋白+单细胞数据分析
强势来袭
一、Highlights
1.ALDH1A3介导的PKM2四聚化诱导GSC糖代谢重编程
2.乳酸的积累增加了XRCC1上K247位点的乳酰化
3.XRCC1的乳酰化通过增加核定位来改善DNA修复
4.通过阻断PKM2，D34-919恢复GBM对放化疗的敏感性
二、研究主要结果
1.ALDH1A3 过度表达通过促进糖酵解代谢导致 GBM 治疗耐药
首先，根据免疫荧光染色将GBM患者分为高表达组和低表达组，发现ALDH1A3 高表达的患者与低表达的患者不同，并没有从术后放疗和化疗中显着受益（图1A）。进一步使用CRISPR-Cas9技术在患者来源的GSC中构建了ALDH1A3敲除和挽救细胞系，分别验证了替莫唑胺 （TMZ） 治疗和放疗的相关表型（图1B-C）。随后，对ALDH1A3编辑的GSC进行RNA-seq和非靶向代谢组学分析，发现ALDH1A3表达或其重新表达的 L-乳酸和糖酵解代谢的产生更多（图1D-J）。
2.ALDH1A3 与 PKM2 相互作用以增强后者的四聚化
接下来，作者探讨了ALDH1A3 驱动的治疗耐受的内在机制。首先，使用免疫沉淀-质谱（IP-MS）分析和一系列的生化测定，发现ALDH1A3和PKM2之间的蛋白质相互作用，并确定了二者相互作用的关键位点（图2A-H）。随后，通过EGS交联测定，发现ALDH1A3和PKM2 的孵育导致了显着程度的PKM2四聚化（图2I）。
3.细胞内乳酸积累相关的XRCC1乳酰化有助于 GSC 的治疗抵抗
通过蛋白质组的代谢修饰，多种代谢物可以影响细胞的生物学功能。作者通过检测到蛋白质组的六种糖代谢修饰，发现GSC中ALDH1A3的缺失独特地改变了蛋白质组的总乳酸化，其中包括参与DNA修复的XRCC1（图3A-C）。更具体的， XRCC1中K247的乳酰化在12个GBM 临床样本出现在细胞质和细胞核（图3G）。接下来，通过静电势分析，发现XRCC1-K247la导致 XRCC1 的表面电荷发生显着变化，从而增强其和importin α之间的亲和力（图3H）。
4.一种小分子化合物通过阻断PKM2和ALDH1A3之间的相互作用来防止神经胶质瘤的治疗抵抗
接下来，作者通过计算机分析和直接蛋白质-蛋白质相互作用实验筛选了靶向 PKM2和ALDH1A3相互作用位点的小分子化合物，最终从超过5000万种小分子化合物中鉴定出97种候选化合物。接下来，通过使用高通量小分子化合物筛选平台（HTCP），确定D34-919是针对PKM2和ALDH1A3之间相互作用位点的最佳候选药物（图4B-F）。随后，通过亲和力分析，D34-919通过四个潜在的结合位点结合PKM2从而逆转ALDH1A3诱导的PKM2四聚化增强（图4G-K）。
5.D34-919 增强放疗和化疗敏感性，抑制小鼠颅内异种移植肿瘤的生长
接下来，作者建立了三组GBM颅内异种移植模型，包括Ⅰ组：肿瘤体积、存活率和体重监测；Ⅱ组：代谢流分析；Ⅲ组：组织病理学染色。每组根据不同处理又分为8个亚组。结果发现，与相应的非治疗小鼠相比，D34-919 + TMZ、D34-919 +放射或 D34-919 + TMZ +放射的联合治疗导致肿瘤生长显着减少，并延长了小鼠的总生存时间（图5A-E）。
随后，作者还测量了D34-919治疗2周后小鼠的乳酸浓度和PK活性来评估 D34-919对体内代谢的影响（图5F-G）。并进一步，通过体外尾静脉注射D-13C6-葡萄糖，发现D34-919治疗组颅内肿瘤中13C标记的乳酸的产生显着降低（图5H）。
6.D34-919增加体内胶质母细胞瘤类器官和脑肿瘤的放化疗敏感性
最后，作者使用12例GBM的患者的手术切除肿瘤样本构建GBM类器官模型，并使用D34-919或TMZ +放射作为单一疗法，或将三者一起作为三重组合疗法，对类器官进行了3天的治疗。使用免疫荧光染色，发现D34-919作为单一疗法或与TMZ和放射组合使用可显着降低XRCC1-K247la水平，Ki-67水平降低（图6A-D）。
图6. D34-919联合疗法有效缩小患者来源的GBM类器官模型中的肿瘤负荷
三、小结
总之，本研究全面研究并确定了ALDH1A3高表达的GBM中PKM2的异常激活和治疗耐药的机制，提出了一种促进代谢重编程的新机制和代谢酶非典型功能的调节途径。并且，作者从表观遗传热点--乳酸化修饰的角度证明了肿瘤代谢和治疗抵抗直接相关，并筛选出了一种小分子化合物D34-919为ALDH1A3hi GBM患者提供了新的治疗选择。
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