微生物生物标志物---癌症筛查分析
3+微生物标志物与癌症功能的方案研究
牙周病是一种慢性炎症性疾病，主要特征是牙龈退缩、牙周韧带破坏和牙槽骨吸收，最终可能导致牙齿松动甚至脱落。尽管牙周病是一个普遍的健康问题，但其复杂的病因学和病理生理学机制尚未完全理解。牙齿由多种细胞类型支撑，角质细胞是牙齿支持组织的重要组成部分，其功能与微生物挑战和免疫反应密切相关，在维持口腔黏膜屏障完整性和抵御微生物入侵方面发挥着重要作用。因此，研究角质细胞在牙周病中的免疫功能和微生物相互作用对于理解疾病的发病机制和开发有效的治疗方法至关重要。
该研究先利用单细胞RNA测序（scRNAseq）技术，分析了人类牙周组织的34个样本，其中20 个健康，4 个牙龈炎，10 个牙周炎。共包括105,918个细胞。通过整合不同研究的数据，生成了人类牙周病的综合单细胞转录组图谱。使用荧光原位杂交（FISH）、多重免疫荧光（mIF）和高通量原位杂交（ISH）等技术，对细胞进行了空间定位和功能验证。
该研究收集了四个不同的单细胞RNA测序数据集，这些数据集涵盖了从健康到牙龈炎再到牙周病的不同阶段。接着，他们使用Cellenics工具对这些数据集进行了预处理、过滤和整合，以便进行后续分析。在数据整合后，研究者们对细胞进行了广泛的注释，并在不同层次上进行了亚类分类。他们还确定了每个亚类的标记基因，并对所有角质细胞进行了广泛的标记。该研究使用CellPhoneDB工具来调查细胞间的通信模式，并通过受体-配体对来分析细胞间的相互作用。
在整合4个不同来源的单细胞数据之后，绘制UMAP图（图2f），对不同细胞类型进行分群。对于每种细胞，绘制细胞和基因的关系图（图2g），其中蓝色标出的牙周细胞。图2h的火山图描述了所有角质形成细胞对牙周炎中某些差异表达基因，差异表达分析揭示了牙周炎中 CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL13、CCL20、CSF3、IL1A、IL1B 和 IL36G 以及受体 IL1R1 和 IL7R 的上调。此外，与所有细胞相比，CXCL1、CXCL8、IL1A 和 IL1B 在角质形成细胞中的对数倍数变化更大。图2i展示了使用 CellPhoneDB，分析所有Tier 3细胞类型的推断受体-配体相互作用;左下角的相互作用更频繁。与其他角质形成细胞相比，SK/JK 似乎对效应细胞因子/其他配体具有独特的表达能力。
沟状SK和交界角质JK形成细胞在牙周炎中显示出改变的分化状态，并富集了效应细胞因子。整合的单细胞数据显示：沟状和交界角质形成细胞与许多其他细胞类型之间的许多相互作用，表明牙周炎中的区域上皮-基质-免疫通讯轴（图2i）。免疫荧光验证 KRT19 是沟状和交界角质形成细胞的最终标志物。通过对从整合的单细胞图谱中对约8500个角质形成细胞进行亚聚类，并鉴定出KRT19高表达细胞聚集在一起（图3d），并绘制群体特征（图3e）。
接下来研究细胞特异性基因上调模式，以深入了解牙周炎中的沟状和交界角质形成细胞。为了更好地了解沟状和交界角质形成细胞的异质性，我们从整合图谱中对 KRT19 高细胞进行了亚聚类，注释了亚群以包括基底（干/祖细胞）及其分化的后代（基底上 [SB] 角质形成细胞;图4b，c）尽管它们相邻，但我们发现牙周炎中和正常环境在沟状和交界角质形成细胞基因有 28.5% 的基因其表达量上调存在重合（图4d的韦恩图）。通常上调效应是细胞因子 CXCL1、CXCL3、CXCL6、CXCL8、IL1A、IL1B 和 IL36G（与 SB SK 相比，SB JK 的 CXCL1 和 IL1B （图 4e）。为了了解沟状和交界角质形成细胞的发育进程和细胞状态改变，该研究使用了基于分区的图抽象 （PAGA）检查基底到基底上的转变，图4f显示出与健康细胞类型相比的基因表达改变，包括KRT17的更广泛表达和JUND、COL17A1和CDH3的更多表达。关键分化基因（如SPRR家族成员）也被下调。图4g显示出强大的细胞信号传导和炎症表型，在疾病状态下似乎会加剧。图4h展示在沟状细胞中，分化相关基因在健康方面与角质形成细胞相比具有独特的表达，但在疾病中也沿着基底到基底上轨迹出现改变。与交界角质形成相比，图4i展示沟状细胞在疾病中的反应性普遍较低，如CXCL1、CXCL8、IL1A、IL1B和IL1RN的总表达较低，沟状和交界角质形成细胞之间的细胞信号变化差异最大。牙周炎的交界角质形成 中 CXCL1、CXCL3、CXCL8、CSF3、IL1A、IL1B 和 IL1RN 均增加;总体而言，沟状和交界角质形成细胞干细胞及其后代似乎以不同的方式上调促炎、免疫调节和先天免疫趋化特征，而牺牲了健康的细胞分化和上皮屏障的维持。这些发现揭示了牙周炎生态位恢复健康的潜在治疗途径，因为与所有角质形成细胞相比，最接近牙齿表面的角质形成细胞驱动了大多数效应细胞因子的表达。
图4：促炎特征的增加与牙齿相关角质形成细胞分化模式的改变相吻合
考虑到多种微生物生态失调导致易感宿主的牙周炎，研究者先使用了健康和牙周炎组织中所有细菌共有的 16S rRNA ISH 探针（图5a），通过单细胞转录组，在去除人源read后，使用Karken2数据库统计不同菌的读数（图5b展示的实验方案）。图5c在健康样本中确定了几个细胞-微生物关联。在患病样本中，可观察到每个细胞的细菌读数要多得多。众所周知的牙龈周围病原体“牙龈卟啉单胞菌”在角质形成细胞中增加最多，近 200 倍，在其他免疫细胞群中增加更大（图 5d、e）。
在确认了沟状和角质形成细胞身份并深入了解了它们分化、免疫信号传导和微生物相互作用的联系后，该研究使用 CellTypist 进一步注释了先天性和适应性免疫细胞群。图6a的CellChat 用于了解健康和疾病中的细胞信号通路。圆圈图突出显示了任何细胞群之间的重要受体-配体相互作用，包括相同细胞类型的信号转导相互作用。图6b展示健康和疾病中的相对信息流显示对细胞粘附（内聚素、胶原蛋白、果酱、层粘连蛋白）和其他通路（如 APP、CXCL 和 MIF 途径）的偏好。在疾病中，更倾向于细胞信号通路，例如 TGFB、TIGIT、CCL、CD45 和 EGF。红色值为 0 表示牙周炎中没有富集通路;红色值为 100 表示高度丰富。图6从和d对先天免疫细胞通讯使用弦图逐个基因测量，以可视化细胞间通讯。研究还发现结构标志物之间的几种先天性和适应性细胞相互作用减少（图6f;）。总体而言，基底角质形成细胞的相互作用减少，表明这些细胞在牙周炎中尤其受到影响。
该研究针对牙周病，先合并已有的单细胞数据，并基于整合数据集选取特定细胞类型进行分析细胞互作和免疫调节，比较健康和疾病环境中的基因表达差异，并通过免疫荧光来进行验证。之后研究新检测的数据，是通过将人源和菌的单细胞转录组同时检测，并对不同物种的菌进行定量，并通过免疫细胞和多菌的互作，考察细胞编程变化，并将这些新细胞中改变的分化模式和上调的角质因子与特定的宿主-微生物相互作用细胞状态联系起来。这项研究对组织中多细菌相互作用的发现进一步提出了关于当前长期牙周炎治疗效果的新问题。通过该文可了解宿主-微生物相互作用将如何允许真正恢复组织生态位，并考虑结合生物膜去除、抗微生物治疗、宿主定向免疫调节和在整个生命周期内频繁维护这个易感生态位的新策略。
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