么嘎！单细胞简直不要太神了，数据在手，分析全有，让我们来探究微生物感染下的细胞动态吧！
这项工作整合单细胞RNA测序和细胞表面抗体测序，系统地解码来自原发性结核病（TB）患者和健康对照组（HC）的外周血单个核细胞（PBMCs）的功能变异。以阐明结核病个体的免疫功能差异，并且提供了来自同一样本的基因组和表型信息。揭示了TB相关的免疫反应是通过宿主T细胞、髓系细胞和NK细胞介导的，同时表现出T细胞的幼稚性、细胞毒性和记忆功能的降低，为结核病的治疗提供新的免疫治疗策略。
5+单细胞探究微生物感染和宿主交互新思路
常规套路，打开疾病新思路
一、背景
结核病（TB）是全球致死的主要原因，主要是由于结核分枝杆菌（MTB）感染引起的。MTB感染过程涉及大量的宿主细胞与病原体的相互作用，如宿主细胞识别病原体相关分子模式（PAMP），MTB释放脂阿拉伯甘露聚糖抑制宿主细胞中吞噬溶酶体的成熟和酸化等。尽管有这些知识，但围绕MTB和人类免疫细胞之间相互作用动力学的功能异质性及其在决定宿主免疫强度和结核病结局方面的作用，仍然知之甚少。感染患者会产生不同水平的免疫反应，具有不同的临床症状或影像学特征，并且具有不同的疾病结局。因此迫切需要全面地了解结核分枝杆菌（MTB）的致病机制及其与人类免疫反应相互作用的性质。目前，已有研究提出宿主免疫细胞比例和细胞状态对于结核病的发生发展起决定性作用。而免疫细胞比例、状态等均与细胞功能密切相关。系统性探究结核病患者外周血免疫细胞功能变化对于解析疾病表型差异，实现结核病精准诊疗具有重要意义。
实验和分析流程
二、结果
1.单细胞水平的结核病相关细胞和转录组学景观
作者利用8名受试者（4名原发性结核病（TB）患者和4名健康对照HCs）的PBMC样本进行ScRNA-seq分析。
通过PCA和UMAP分析后，基于共享最近邻(SNN)模块化优化的聚类分析将23990个细胞划分为17个不同的聚类。利用标记良好的标记基因和AbSeq结果T细胞、髓样细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK）、血小板和增殖细胞其中T细胞在两组中所占比例最大（TB患者为42.63%，HCs为42.21%），其次是髓样细胞（分别为25.84%和31.58%）（图1）。
图1：基于scRNA-seq和AbSeq的单细胞分析
2.解读结核中T细胞的异质性
对T细胞进行第二次细胞聚类，以剖析其亚型在结核病中的行为。UMAP图展示对10371个T细胞的11个簇细分为4个CD4+T细胞亚群、3个CD8+T细胞亚群、2个非典型T细胞亚群和1个增殖细胞亚群。并且研究发现TB组的免疫抑制性(CD4+调节性T细胞)和非免疫抑制性T细胞(其他T细胞亚型)的比例高于HC组。富集分析进一步表明，结核患者的炎症相关通路明显受到抑制，这初步证实了结核分枝杆菌有可能破坏宿主免疫平衡，并使其倾向于免疫抑制（图2）。
图2：T细胞的聚类和细胞亚型分析
3.定量评估结核相关的T细胞功能变化
进一步将所有T细胞分为幼稚细胞、细胞毒性细胞、调节细胞和记忆细胞。
通过发现队列(a,d,g,j)，独立scRNA-seq数据集(b,e,h,k)和批量数据(c,f,j,l)，的TB组和HC组之间进行分析验证，展示4个T细胞亚群的功能能力差异。这些结果表明，结核病患者的免疫功能对宿主免疫强度有积极影响的功能(初始、细胞毒性和记忆功能)下降，但对宿主免疫调节功能没有负面影响（图3）。
图3：基于发现队列，独立scRNA-seq数据集和批量数据，TB组和HC组之间4个T细胞亚群的功能能力差异
4.T细胞发育轨迹及代表性基因表达模式的研究
我们确定了结核病相关的T细胞功能变化情况，随后对CD4+和CD8+T细胞亚型的进行伪时间分析，分别用状态、细胞亚型、伪时间和组着色。CD4+T细胞中代表性基因(CCR7、GZMA、FOXP3和LTB)和CD8+T细胞中代表性基因(CCR7和GZMA)在伪时间发育过程中的表达模式。
幼稚CD4+T细胞发育为记忆细胞、调节细胞或效应细胞。记忆性CD4+T细胞也可以分化为效应T细胞。这种分化轨迹可能是因为8名曾接受卡介苗接种史的参与者对MTB再次刺激。幼稚CD8+T细胞位于分支2。效应T细胞主要分布在分支1、5和3的末端，而效应记忆T细胞位于两者之间，表明该细胞亚型是中间形式。在这两种亚型中，CCR7的表达随着细胞分化而下降，而其他代表性基因（GZMA,FOXP3,LTB）的表达增加。表明幼稚细胞通过转录组重编程逐渐获得细胞毒性、免疫调节和记忆功能，并分化为其他形式（图4）。
图4：CD4+和CD8+T细胞亚型的发育轨迹及代表性基因的表达模式
5.解码髓样细胞的结核病相关行为
作者根据文献报道知道髓样细胞是结核病中主要改变的细胞类型之一，强调了它们在发病机制中的重要性。
因此对6855个髓样细胞进行了重新聚类分析，并将它们分为16个簇和8个亚群，包括4个单核细胞亚群、2个树突状细胞亚群、1个巨核细胞样细胞亚群和1个增殖细胞亚群。髓系细胞亚群比例没有显著变化，但功能上存在差异，提示髓样细胞参与结核病（图5）。
图5：髓样细胞的聚类和细胞亚型分析
6.B细胞和NK细胞的特性表征
根据前面的研究发现结核患者的B细胞丰度降低，因此又进一步将2035个B细胞重新聚类，并将其分为6个亚群幼稚B细胞、记忆B细胞和巨核细胞样细胞。其中巨核细胞样细胞是主要减少的细胞亚型。
在TB和HC组之间的相同信号通路中，每种B细胞亚型的信号通路朝着相同的方向变化。与这些信号通路相关的许多基因(S100A9、CXCR4等)在两组间表达存在差异。这些结果提示，B细胞亚型的功能变化可能与它们的丰度有关，而不是与它们的转录组特征有关。在基因调控网络中，XBP1则表现为一个“枢纽基因”，参与了123个基因的表达，是控制B细胞分化的有前途的靶点（图6）。
图6：B细胞的聚类和细胞亚型分析
转录数据显示，与HC组相比，TB组的IRF1和MAP3K8表达降低。GO分析表明，这些基因主要与T细胞和B细胞活化相关，提示MTB可通过靶向NK细胞间接影响其他免疫细胞。此外，我们发现一些差异表达基因(如KLRC1和KLRC2)富集到NK细胞细胞毒性和白细胞迁移通路中，揭示了NK细胞在TB中的多样性和重要作用。通过构建基因调控网络，发现DUSP1是JUN、JUNB、JUND和FOS的共调控基因。根据已知DUSP1参与丝裂原激活的蛋白激酶信号通路和炎症因子(TNF-rr、IL-6、CCL3、CCL4)的释放。因此，靶向激活NK细胞中DUSP1的表达可能是调节炎症相关反应的一种潜在途径(图7)。
图7：NK细胞的转录图谱
7.结核相关细胞通信的鉴定
使用iTalk来表征TB和HC组中的细胞通讯。在HC组中，中间单核细胞与其他亚型的相互作用最频繁，而髓样树突状细胞接收的相互作用信号最多。在TB组中，巨核细胞样细胞发送和接收的相互作用信号最多，而CD8+幼稚细胞的相互作用信号最少。TB和HC组中差异分析显示，VEGFA和ITGA9仅负责髓系树突状细胞和CD4+调节性T细胞之间的通讯。TB组中VEGFA表达增加增强了髓系树突状细胞向CD4+调节性T细胞的信号传导。
根据文献报道显示，VEGFA和ITGA9都已被发现与肿瘤环境中的细胞增殖密切相关。由此推断，VEGFA-ITGA9可能与髓系树突状细胞和CD4+调节性T细胞之间的通讯改变、免疫抑制和非免疫抑制细胞失衡之间存在潜在关系。此外，根据TB组与HC组之间细胞通讯的差异分析发现CD4+调节性T细胞主要通过GNAI2与其他T细胞亚群的相互作用，S1PR（鞘氨醇-1-磷酸受体）是GNAI2靶向的主要受体，在免疫细胞运输和细胞因子产生中发挥关键作用。因此，TB患者中GNAI2表达的降低可能会干扰免疫细胞的运输和细胞因子的产生（图8）。
图8：细胞通信的网络和circos图
三、结论
作者系统地研究了不同细胞亚型与结核病相关的功能改变，并证明了TB中T细胞的幼稚性、细胞毒性和记忆功能的降低，这可能通过改变基因表达谱、细胞丰度和细胞通信来实现。这对宿主的免疫强度而不是它们的免疫调节功能有积极贡献。综合研究结果，能够详细描述结核病的免疫功能变化，这有可能为新的免疫治疗策略产生新的靶点，使T细胞从功能失调或耗竭的状态中恢复过来。
5+单细胞探究微生物感染和宿主交互新思路
常规套路，打开疾病新思路
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4、R语言入门
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