呼吸微生物微生态失调与危重患者的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和医院获得性肺炎（HAP）有关。然而，缺乏可重复的呼吸道微生物组特征，无法增加对这些疾病和潜在治疗方法的了解。今天的这篇文章发表在nature medicine（IF：82.9）,作者确定了与ARDS、HAP和长期机械通气相关的微生物群特征，有助于确定危重患者微生物组治疗调节的有希望的靶点。
背景
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和医院获得性肺炎（HAP）是危重症患者最常见的呼吸系统并发症，也是延长机械通气和死亡的重要驱动因素。尽管在确定最佳机械通气设置和抗菌治疗方面取得了进展，但ARDS和HAP的辅助治疗选择仍然有限。需要更好地了解这些疾病的潜在病理生理学，以使创新疗法的发展。ARDS和HAP之间存在临床重叠，因为继发性肺部感染是ARDS患者的常见并发症，严重的HAP也可发展为ARDS。对ARDS和HAP的比较研究可以增加对这些疾病原因的了解。
对从呼吸分泌样本中提取的核酸进行非培养、高通量测序表明，尽管肺部含有高度多样化的微生物群落，统称为肺微生物群。在大多数健康个体中发现的一组五种细菌，由普雷沃菌属、链球菌属、细孔菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属组成，被认为是肺稳态所必需的肺核心微生物群。对重症监护病房（ICU）患者的微生物组调查为ARDS和HAP患者的呼吸微生物生态失调提供了支持性证据。由于这些微生物组调查的大部分数据都是在单中心研究中产生的，因此可重复的微生物组特征尚未被开发出来。
与HAP和ARDS相关的呼吸微生物群失调的特征尚未得到彻底的比较，这一知识差距限制了针对预防和治疗这些疾病的微生物群靶向干预措施的发展。作者推断，对与ARDS和HAP相关的呼吸生态失调的比较研究将有助于识别特定的特征，从而提高对这两种情况之间的联系和差异的理解，并为开发共同和特定的创新微生物组靶向方法铺平道路。因此，本研究的目的是利用公开的数据和在一个独立队列中的验证，定义与ARDS和HAP的病理生理学相关的稳健的呼吸微生物组特征。
数据汇总
作者纳入了17项基于16S基因的微生物组的研究，这些研究调查了在ICU住院的患者或健康对照组的呼吸微生物组。所有报告ARDS结果的研究使用的诊断标准符合柏林轻至重度ARDS。所有报告HAP发生的研究均根据国际指南采用临床和放射学指导诊断HAP,3项（43%）也包括微生物学标准。从2177个呼吸样本中收集了个人数据，包括从1029名危重患者中获得的310个支气管肺泡灌洗液（BAL）、1083个气管内吸出物（ETA）和784个口咽拭子（OPSs）。样本采集的中位时间为ICU入院后第1天（四分位间距（IQR）第1-5天）。ARDS和HAP分别诊断为223例（21.6%）和271例（26.3%）。共从符合HAP和ARDS标准的患者中收集173份（11.2%）样本。从四项研究中获得了327个健康个体样本的数据。
结果
ICU中患者呼吸微生物群的特征分析
首先评估了从危重症患者中收集的样本是否与从健康个体中收集的样本不同。作者通过主坐标分析观察到，来自ICU患者的所有样本（BALs、ETAs和OPSs）的呼吸微生物群与来自健康个体的呼吸微生物群不同（图1a）。然后，作者研究了呼吸微生物群的alpha多样性。该方法将每个样本中的物种丰度分布汇总为一个数字，并取决于物种丰富度（一个样本中的物种数量）和相对丰度（均匀度）。危重症患者的Alpha多样性低于健康对照组（图1b）。
在2117份危重患者样本中，作者发现6个最常见的属中有5个属于健康的呼吸核心微生物群（图1c）。然而，危重症患者中健康呼吸核心微生物群的相对丰度低于健康对照组（图1c）。更具体地说，危重患者中梭菌、细孔菌和普氏菌的相对丰度较低，而嗜血杆菌的相对丰度明显较高。53%的危重症患者中出现假单胞菌，平均相对丰度达到5.3%。ICU患者中假单胞菌的相对丰度与健康呼吸核心微生物群属的相对丰度呈负相关（图1d）。这一系列的分析表明，危重症疾病与呼吸系统的生态失调有关。
然后，作者发现BALs、ETAs和OPSs具有显著不同的beta多样性，并且与预期的那样，alpha多样性从OPSs到BALs逐步下降（图1e）。在属水平上，只有2个健康核心微生物群成员（链球菌和普雷沃菌）在BALs、ETAs和ops中常见，但它们的相对丰度随取样地点的不同而不同（图1f）。在ICU患者中，假单胞菌属从上呼吸道（OPSs）到肺泡腔（BALs）的替代程度有所增加（图1g）。
随后作者发现，以UpSet图的集合大小为代表的ICU呼吸核心微生物组的丰富度在OPSs和ETAs中高于在BALs中。然而，从UpSet图的交集大小可以看出，这种特征在BALs和ETAs中比在OPS中更频繁（图1h）。考虑到ETA的非侵入性和可重复性，作者优先开发ETA样本中的微生物组特征。
图1危重症患者沿呼吸道呼吸微生物群的改变
ETA样本中的ARDS微生物组评分
为了建立ARDS的呼吸微生物群特征，作者选择了危重症患者，他们在ICU住院的第一周收集了一个或多个ETA样本，并可获得ARDS结果。作者发现，来自ARDS患者的ETA样本与来自无ARDS的危重患者的总体beta多样性有显著差异（图2a）。ETA样本的alpha多样性在ARDS患者和非ARDS患者之间无统计学差异（图2b，c）。相关网络分析显示，这些组患者之间的物种之间的关系不同（图2d，e）。值得注意的是，链球菌的高相对丰度与无ARDS患者中葡萄球菌的低丰度相关。
接下来，作者选择了使用Mann-Whitneyu检验和偏倚校正（ANCOM-BC）微生物组组成分析与ARDS相关的顶级特征（即ARDS患者和非ARDS患者之间丰度不同的属），鉴定了30个ARDS相对丰度不同且没有ARDS微生物群的属（图2f）。然后，作者使用了一个由光谱聚类和快速和节俭的树（FFT）组成的堆叠机器学习模型，使用最小数量的标准来定义一个简约的预测分数。基于FFT的建模提供了一个简单的三因素决策树，根据葡萄球菌、拉尔斯顿菌和肠球菌的存在，将样本单独分类为“ARDS”（图2g）。作者应用了一个10倍交叉验证方案来检验模型的准确性，并计算出平均分类AUC为0.751（图2h）。由FFT模型定义的无ARDS特征的患者比具有ARDS特征的患者拔管成功的概率更高（图2i）。具有ARDS微生物组特征的患者死亡率为37%，而无ARDS特征的患者死亡率为27%，进一步支持了这个基于FFT的分类的临床相关性。
图2 ETAs中ARDS的呼吸微生物组特征
HAP微生物组评分
然后，作者在一个至少有一个ETA样本和一个HAP结果的参与者队列中开发了一个与HAP相关的微生物组特征。在纳入的738例患者中，484例患者在基线或随访期间出现HAP。作者观察到，在对HAP患者进行了调整后，ETA患者的总体结构存在显著不同（图3a）。从HAP危重患者收集的样本中，微生物组alpha多样性低于从无HAP患者收集的样本（图3b，c）。有无HAP患者的ETA微生物组组成在门水平上存在差异，HAP患者的变形菌门相对丰度增加。链球菌和韦氏杆菌的相对频率与假单胞菌的相对频率呈负相关（图3d，e）。
顶级特征选择确定了66种微生物，这些微生物在有和没有HAP患者的样本中差异丰富（图3f）。基于FFT的建模提供了与HAP分类相关的四因素决策树（图3g）。值得注意的是，HAP与链球菌和细孔菌的低相对丰度相关，这两个属属于健康的呼吸核心微生物群。作者应用了一个10倍交叉验证方案来检验基于FFT的HAP分类模型的准确性，并计算出平均预测AUC为0.72（图3h）。由FFT模型定义的没有HAP特征的患者比有HAP特征的患者拔管成功的概率更高（图3i）。具有HAP特征的患者死亡率为32%，而没有HAP微生物组特征的患者死亡率为29%。作者在BAL样本中测试了该模型，并观察到HAP分类的准确性下降，这并不支持该FFT模型对远端样本的通用性。
图3 ETAs中HAP的呼吸微生物组特征
早期成功拔管的微生物组特征
检测独立于ARDS或HAP诊断的微生物组特征是能够预测临床结果的重要因素。成功拔管（即脱离机械通气）是一个重要的以患者为中心的结果。因此，作者测试了定义一个微生物群特征是否可以预测危重症患者成功拔管的时间。在有ETA样本的ICU患者群体中，所有样本都是在脱离机械通气之前采集的，成功拔管的中位时间为 ICU入院后第10天。因此，作者开发了一个评分来预测早期（<4天）与晚期（>10天）拔管成功的情况，并发现了与这些结果相关的18个特征（图4a）。基于FFT的模型基于乳酸菌目、玫瑰菌和链球菌的相对丰度（图4b），提供了早期成功拔管分类的三因素决策树。作者应用10倍交叉验证方案来检验基于FFT的早期成功拔管预测模型的准确性，并计算出平均预测AUC为0.727（图4c）。
图4在ETAs中成功拔管的呼吸微生物组特征
在一个独立的前瞻性队列中进行外部验证
最后，作者在ICU前瞻性独立队列中验证这些评分的准确性。作者分析了277例在入院后第0、4、7天收集的ETA样本，共纳入136例需要有创机械通气的脑损伤患者。ARDS和HAP的发生率分别为38%和51%，所有ARDS病例均与严重HAP相关。
作者证实，有和没有ARDS患者、有和没有HAP患者以及早期拔管和未拔管的患者之间的呼吸微生物组结构存在差异（图5a-f）。基于ETA的严重脑损伤患者中，ARDS、HAP和早期拔管微生物组FFT成功评分显示了令人满意的结果（图5g-i）。作者还观察到，基于三因素或四因素FFT的ARDS、HAP或延长机械通气微生物组特征的患者比没有特征的患者成功拔管的时间更长（图5j-l）。
图5在独立前瞻性队列中呼吸微生物组签名的外部验证
小结
虽然HAP和ARDS的临床表现经常重叠，但作者定义并验证了两种不同的呼吸微生物组特征。HAP特征主要表现为健康微生物群丰度低；相反，ARDS特征由高水平的致病菌组成。这种观察可以大大影响这两种情况的诊断，建议两种不同类型的微生物组操作潜在的治疗：恢复共生细菌预防和治疗HAP，和积极的针对病原体的治疗，不改变共生细菌在ARDS患者。
考虑到呼吸微生物组组成的个体间的高变异性，益生菌不太可能使所有危重症患者受益。因此，使用有限数量的细菌，开发和验证节俭分数来预测个体结果，是本研究的一个重要成果。然而，即使实时宏基因组学能够在细菌性肺炎中快速识别病原体，由于ICU中高通量测序仪的获取有限，目前还不能在床边实施。标准化的快速多重PCR面板准确地识别了HAP患者呼吸液中的数十种细菌种类，并在采样后的几个小时内提供结果。虽然目前大多数快速生物分子检测的目的是识别病原体，但监测健康共生细菌的丰度可以包括在这些生物分子检测中，以预测个体反应并指导床边治疗。
总而言之，作者的发现对于描述特定的ARDS和HAP呼吸微生物组特征并将它们与不良的临床结果联系起来至关重要。三到四因素的决策树增加了作者对这些疾病的病理生理学原因的理解，并可以形成诊断分析的基础，以指导临床实施。作者的证据合成可以为未来的工作提供信息，旨在机械地研究呼吸微生物群对肺部免疫和炎症的贡献，并可以帮助定义危重患者中特定微生物群调节的有前途的治疗靶点。
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