组织样和PBMC联合，更适合疾病进展、转移耐药前后。
更大视角，三维结构，动态变化
一．文章摘要
研究的主要流程如下图所示。首先，文章收集了数百个小鼠正常、癌前乳头状瘤病变和皮肤鳞癌（CSCC）样本的bulk表达数据，并基于这些bulk表达数据识别了干性基因相关网络，并将这些网络命名为组织特异metagene。接着，研究将metagene与谱系追踪和单细胞测序相结合，最终揭示了两种趋同的癌前细胞干性状态。研究分析还发现这两种干性状态分别与细胞增殖和谱系可塑性有关，并且呈现出互斥关系。此外，文章也观察到化疗和分化抑制可以导致细胞增殖干性状态和谱系可塑干性状态转变。这一结果意味着操纵这个细胞状态转变点可能为癌症治疗提供潜在的组合靶点。
二．文章的主要内容及结果
1.肿瘤干细胞基因表达网络的重构
文章第一部分利用bulk表达数据研究了肿瘤与正常（NSk）干细胞基因网络的区别。研究分析了不同遗传特征小鼠的106个NSk和157个肿瘤样本的干性基因表达(图1A)，结果观察到经典干性基因表达在肿瘤样本中能够聚类为三簇（Spearman组1-3），但在正常组织中却不会(图1B和C)。其中Spearman组1与Spearman组3展示出强烈的负相关性（图1C）。接下来研究将每个干性基因作为种子基因，并识别肿瘤、癌前与肿瘤样本中与其最相关的100个基因，构建组织特异性干性基因相关网络(称为metagene)。研究观察到在致癌过程中这些网络会重排。文章接着对小鼠的正常、癌前病变及肿瘤样本进行单细胞测序，并对这些细胞聚类并注释（图1D）。
图1 组织及单细胞表达数据分析
2.将干性metagene从组织数据映射到单细胞测序数据
文章接着在单细胞数据中研究了上面识别的组织特异性metagene。文章特别关注了干性经典Lgr6和Lgr5基因在皮肤细胞中的作用和表达模式。研究首先观察到Lgr6在上毛囊峡区和毛囊间上皮中的表达，这些区域在正常体内平衡和伤口愈合中被Lgr6+细胞重新填充（图2A）。而Lgr6 NSk metagene被观察到在滤泡间角质形成细胞中表达增加，并在表皮终末角质化细胞中达到峰值（图2B）。此外，Lgr6肿瘤metagene被观察到在肿瘤中高表达（图2C）。基因Lgr5则被观察到在毛囊下凸起区域高表达（图2D）。与Lgr6不同，Lgr5也被观察到在癌变的各个阶段都低表达，这表明它们在干性重排中具有差异（图2E，F）。此外，研究也观察到metagene在癌前病变单细胞群中呈现出表达趋同，其中Spearman组3的基因在癌前细胞UMAP图的下尖峰倾向一致高表达，Spearman组1的基因在上尖峰一致高表达（图2G）。这也表明Spearman组1和3代表了两种不同的干性状态。
图2 干细胞种子基因和metagene的单细胞表达
3.lgr6阳性的癌前病变细胞可产生不同干细胞群
研究接着分析了不同干性状态细胞间的关联。由于基因Lgr6是干性克隆的主要驱动基因，因此研究首先探索了两个干性细胞群与Lgr6的关系。研究通过谱系追踪和免疫荧光分析观察到NSk中Lgr6+细胞重新填充上毛囊和毛囊间表皮(图3A)，而癌前病变乳头瘤中Lgr6+上皮细胞主要位于基底膜(图3B)。研究近一步观察到肿瘤中Lgr6+细胞展现出高度无序的组织水平结构(图3C)。
接着研究通过流式细胞术将NSk、乳头状瘤和肿瘤中的Lgr6+干细胞和各自的子代细胞中分离出来，并检查这些细胞在UMAP中的分布，结果观察到Lgr6+细胞在上尖峰细胞中显著富集(图4A)。接下来，研究进行了阶段特异性差异表达基因(DEGs)分析，比较Lgr6+和子代细胞，结果观察到相对于Lgr6+细胞，子代细胞中增加最多的DEGs在低尖峰细胞中表达最高(图4B)。研究接着分析了干细胞metagene的表达变化，结果观察到Spearman组3 metagene在Lgr6→子代轨迹上的表达增加(图4C)。相反，Spearman组1在Lgr6→子代轨迹上表达减少。综上所述，这些干细胞网络表达在Lgr6→子代谱系中的差异暗示了这些细胞中干细胞基因之间的等级关系，这也代表了两种高度不同的细胞命运。
图4 Lgr6及子代细胞形成癌前乳头状瘤的低尖峰并高表达Spearman组3程序
4.低尖峰细胞状态与耐药有关且在小鼠和人类肿瘤中保守存在
由于细胞干性通常与耐药有关，因此文章接着探索了不同干性状态细胞与耐药的关联。文章首先基于人前列腺癌单细胞数据分析了小鼠干性状态细胞与人的同源性(图5)，该数据包括13个前列腺肿瘤和11个健康前列腺的对照样本。研究在PAD单细胞数据中分析了识别的低尖峰细胞基因特征的人类同源物，结果观察到它定位于PAD的一小部分人群(橙色箭头，图5B)。研究也通过检测一组标记PAD中耐药干细胞的基因的表达验证这一点(图5D)。研究在小鼠数据中解析这些人类基因时观察到它们的联合表达在低尖峰细胞中最高(图5C)。这些结果表明低尖峰细胞状态沿着小鼠-人类同源性在两个方向上重现。
图5 低尖峰特征基因在同源人前列腺癌中的再现反之亦然
文章接着分析了低尖峰细胞与化疗的关联。通过分析顺铂治疗与对照肿瘤的DEGs，研究发现参与耐药的基因显著上调(图6A)。在原始数据中绘制来自这些独立肿瘤的上调基因的表达发现它们在低尖峰中表达最高(图6B和C)。研究还分析了顺铂治疗上调的基因与低尖峰标记基因之间的重叠是否大于偶然预期(图6D)，结果发现上调的顺铂DEGs与低尖峰标记物比预期的更多。这些结果表明，顺铂靶向有丝分裂细胞减少了上尖峰细胞的数量。研究接着通过抑制低尖峰分化细胞来测试是否可以反过来激活高尖峰细胞状态。研究使用Pp2a来实现这一目标，研究在体外用强效Pp2a抑制剂处理了两种小鼠SCC细胞系，并量化了其表达差异(图6E)，结果发现差异基因在上尖峰高表达，而在下尖峰显著低表达(图6F)。因此，研究将这两种尖峰细胞状态解释为可通过选择性治疗压力切换的细胞替代命运。
最后研究为了将这些观察结果整合到单细胞分辨率癌变的连贯进化轨迹中，用伪时序和拷贝数变异分析了单细胞数据。研究对单细胞数据进行伪时间推断(图7A)，结果观察到肿瘤细胞的发育时间晚于乳头状瘤。此外，研究也推断了单细胞内的拷贝数改变(图7B-F)，结果观察到上面的尖峰很少有非整倍体细胞，这表明这些是早期的癌前细胞。此外，在乳头状瘤中7、6、10和1号染色体的非整倍体密度明显增加(图7C-F)。
到这里文章的主要结果就介绍完了，总结一下文章利用多阶段小鼠模型揭示了致癌过程中干细胞向恶性肿瘤转化的过程（图8）。
研究对干细胞状态趋同现象的研究不仅有助于理解癌症发展的基础机制，还可能为开发新的治疗策略提供突破口。此外，针对干细胞状态的治疗策略可能会更有效地干扰肿瘤的生长和复发。而文章将bulk组织采样的宽度和单细胞的高分辨率整合追踪样本细胞状态的巧妙思路也十分值得我们参考学习。
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