邵正萍团队Trends in Genetics综述丨PARP1失活的复杂世界

生命科学

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近日，浙江大学医学院邵正萍研究员团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Trends in Genetics发表了题为“The Complex Universe of Inactive PARP1”的综述。该论文围绕抑制剂或突变致失活的PARP1，从PARP1结构基础、 PARP1抑制剂的抑制效应和阻滞现象、PARP1失活性突变的特性以及小鼠模型等方面，深入探讨了PARP1失活的多样性，及其对蛋白动力学、DNA修复功能和生物学结果的影响，和作为多种癌症或其他代谢疾病靶点的潜力，为未来的研究方向和治疗策略提供了重要的见解。

聚ADP-核糖（PAR）聚合酶-1（PARP-1）是PARP家族蛋白中最重要的成员，负责超过80%的细胞内的多聚ADP核糖基化(PARylation)活动，在一系列细胞生命过程，特别是DNA损伤修复中起了至关重要的作用。PARP1 被各种形式的 DNA 损伤激活，并参与不同的DNA 修复途径如DNA单链断裂(SSB)、DNA双链断裂的同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)、DNA复制、以及冈崎片段的连接等，也结合DNA发卡结构、十字结构和G多聚体。除此之外，PARP1参与染色质重构、基因转录、RNA生物学、代谢调节、炎性反应和程序性死亡等多个生命过程（图1）。目前，PARP抑制剂（PARPi）正在成为一种颇具前景的伴 HR 缺陷的晚期癌症治疗方法。PARPi 的机制包括两个方面：对PARP1催化活性的抑制，以及造成PARP1 在 DNA 损伤处的滞留。很多研究认为，在肿瘤治疗中，PARP1蛋白滞留的治疗获益甚至高于催化失活，但蛋白滞留的机制依然有很多争论。最近在动物模型中的研究也表明了现在的PARP1失活靶向策略具有潜在的副作用风险。深入的理解PARP1的失活以及对蛋白动力学和相关生物学过程的影响，对PARP1的深入了解及辅助不同策略靶向药物的开发都至关重要。

PARP1的结构及其激活

因为化学抑制剂或基因突变的原因，导致存在的PARP1蛋白即使在激活后也无法催化产生多聚ADP的现象即为PARP1蛋白失活。PARP1失活是PARP抑制剂肿瘤治疗的基础。而PARP1的酶活性与其蛋白结构息息相关。人类PARP1蛋白包含1014个氨基酸，主要由N端DNA结合域（DBD）、中部自修饰结构域（AD）和C末端催化结构域（CAT）组成。PARP1的激活涉及蛋白与DNA的结合，以及一系列的变构效应。PARP1通过DBD结构域中的锌指结构域（ZF）与DNA相结合，通过变构效应导致HD结构域的水解，打开CAT结构域中的催化口袋并暴露活性位点，使得NAD+可以进入，从而完成PARP1的激活。激活的PARP1利用NAD+为底物，将ADP转移到底物蛋白，形成多聚ADP链，对自身（主要位于AD结构域）以及其他蛋白的天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸位点完成PARylation。

PARP1的N端结合DNA后，与WGR结构域形成紧密接触，并通过变构效应暴露活性位点，使NAD+可以进入ART结构域的催化口袋。催化口袋中催化核心的H-Y-E三联体，由 H862、Y896 和 E988 组成，是PARP1催化活性的关键位点。它们负责抓住NAD+，切下烟酰胺部分并将ADP核糖部分共价附着于底物上，产生PAR链。此外， CAT结构域中的其他氨基酸，如K893和D993等，也对PARylation活性起着至关重要的作用。

PARP抑制剂（PARPi）引起的PARP1失活

最常见的PARP1失活方式是使用抑制剂。PARPi是一组烟酰胺类似物，通过与 NAD+竞争PARP催化结构域的活性位点以抑制PARP1活性，阻止PARP形成PAR链。目前已有四种PARP抑制剂 Olaparib（奥拉帕利）、Rucaparib（鲁卡帕尼）、Niraparib（尼拉帕尼）和 Talazoparib（尼拉帕尼）经美国食品药品监督管理局（FDA）批准可用于晚期卵巢癌治疗。

目前认为，PARP抑制剂的治疗机制来源于两个方面：抑制PAR链的形成，及对PARP1蛋白的阻滞效果。阻滞最早的定义是单个PARP1分子在抑制剂作用下结合在DNA损伤部位的时间延长，然而，近年的研究表明PARP1在DNA末端的停留可能来源于未修复的DNA持续性的招募不同的PARP1蛋白。因PARP1的阻滞可以阻碍其他修复通路的蛋白对DNA末端的处理，蛋白阻滞是PARP抑制剂合成致死的重要机制。不同的PARPi在对PARP1达到相似失活效果的同时所造成的PARP1阻滞效果并不相同。PARP抑制剂造成PARP1阻滞的机制至今未明，早期研究认为形成的PAR链携带的大量负电荷可通过电荷互斥效应将PARP1从同样带负电的DNA末端推离，因此PARPi的阻滞能力与其抑制能力成正比。然而，虽然talazoparib具有最高的PARP1失活效力也表现出最强的阻滞能力，但Niraparib和Olaparib的阻滞效果却和其催化能力并不符合。

变构假说则认为PARPi与PARP1蛋白催化口袋的结合可通过变构效应影响前端ZF结构域与DNA的结合能力。不同的PARPi因为结合的氨基酸位点不同，带来的变构不同，呈现出不同的变构效应。基于PARPi对蛋白与DNA结合能力的影响，变构假说将现有的PARP抑制剂分为三类：促进PARP1阻滞（如EB-47和BAD）；对滞留无影响（talazoparib和Olaparib）；以及降低蛋白对DNA的亲和性并促进解离（rucaparib，niraparib和veliparib）。改造veliparib的结合位点促进了蛋白阻滞，证明了变构假说的合理性。然而，理论上应对滞留无影响的talazoparib实际上却促进了蛋白的滞留。这表明变构假说的出现深化了对PARP1阻滞机制的理解，但仍存在未解之谜。除此之外，其他的因素，包括HPF1的参与，以及各个自身修饰位点可能的不同作用，也可能参与PARP1蛋白动力学的调节。PARP蛋白阻滞的机制仍需进一步研究。

PARP抑制剂在肿瘤和其他疾病治疗中的应用

PARPi最初被批准用于治疗BRCA1或BRCA2缺陷的晚期卵巢癌治疗，并逐步扩展到其他癌症类型，并明显提高了无进展生存期（PFS）。然而，现有的PARPi治疗易产生耐药性，并且有较高的毒副作用，限制了PARPi的广泛应用。PARPi可能的耐药机制包括HR的恢复、NHEJ的改变、复制叉的稳定、和PARP1蛋白本身的丢失或突变等等。PARP1的阻滞作用可能在抑制缺乏HR的肿瘤细胞中比其失活更为关键，因为非阻滞性的PARP1失活突变体R591C的表现对PARP抑制剂的耐药性。为了抵抗PARPi的耐药性，临床通常推荐联合治疗策略，然而，由于耐药机制涉及的通路太多，往往防不胜防。除了恶性肿瘤外，研究也表明PARP抑制剂可能对一些神经退行性病变、心血管疾病和免疫相关性疾病具有良好的改善作用，然而仍需进一步的临床试验验证。

PARP抑制剂常见的临床毒副作用包括血液毒性、胃肠失调、乏力和肝脏毒性等。此外，某些抑制剂也表现出了其特有的毒副作用：如rucaparib会出现的消化不良、吞咽困难、肌酐升高、皮损；以及niraparib常出现的高血压。这些副作用则可能因不同的PARPi阻滞效果、化学结构或脱靶效应不同，而对细胞不同过程产生的间接影响。

PARP1失活突变体的多样性

与PARP抑制剂相比，PARP1的突变排除了脱靶效应的影响，这为理解PARP1提供了更精确的工具。可以改变催化活性的突变遍布整个PARP1蛋白。不同结构域上的PARP1突变通过不同的机制影响PARP1的活性：如BRCT结构域上的S499、S507和S519突变影响了HPF1依赖性的催化活性；在HD（例如L713F/A、L765A、L768A和A774L/S）和ART（例如A870L/S和A871L/S）结构域的一些突变会影响阻止NAD+进入催化口袋的HD结构域的正常折叠，导致PARP1始终处于一种DNA非依赖性的高活化状态；WGR结构域上的突变会影响PARP1的ZF-WGR-HD结构域的相互作用进而影响PARP1的活性；ZF结构域的突变影响PARP1与DNA结合而活化（图2）。

相比于突变导致的催化活性改变，突变对蛋白阻滞效果的影响仅仅在部分研究中进行了检测。与催化活性假说一致，变体713F/A并未造成蛋白阻滞。但对H862D、E988K/A、R591A/C等催化失活突变体的阻滞能力研究中发现，PARP1不同结构域的突变失活对其阻滞能力产生不同程度的影响：H862D造成了物理性的蛋白阻滞，E988A/K仅仅造成了较轻程度的阻滞，Y907T/A并未造成阻滞，而R591A甚至可以解救H862D造成的阻滞。这些研究进一步支持了PARP阻滞的变构假说，并提示了探寻新的PARP1抑制靶点的可行性。

PARP1缺陷小鼠模型

PARP1缺陷的小鼠模型在机体水平为PARP1生物学功能的理解提供了强有力的工具。世界上第一个PARP1敲除小鼠模型由Wang等科学家在1995年建立。尽管PARP1在众多生命活动中具有重要作用，PARP1小鼠可正常存活并繁育，但对辐射、烷化剂和剪辑损伤药物敏感。这些小鼠和提取的细胞还表现出基因组不稳定性的特征，但对炎症、缺血和内毒素有较高抵抗力。

与PARP1敲除小鼠模型相比，PARP1失活或活性较低的敲入小鼠模型对于清楚地理解PARP1研究中“阻滞”和“失活”的作用至关重要。迄今为止报道的三种PARP1失活小鼠模型中，Schuhwerk等研究者最早建立的PARP1-D993A模型与PARP1敲除的小鼠模型相似，除了对DNA损伤试剂过度敏感外并无其他发育或肿瘤性异常，该突变对PARP1蛋白动力学的影响未知；Shao等人创建的PARP1-E988A小鼠模型则是一个PARP1阻滞的失活模型，该突变体在DNA损伤处的滞留类似于尼拉帕尼抑制的效果。该突变F1代杂合体小鼠除体型较小，和尾骨发育异常等轻微基因组不稳定性特征外，并无明显异常。提取的细胞虽对DNA损伤剂更敏感，姐妹染色单体交换和染色质桥形成频率也有增加，但DNA双链断裂的HR和NHEJ修复途径无明显缺陷。然而，PARP1-E988A的表达以显性负相关的方式影响了胚胎发育：F2后代中胚胎发育E9.5天后无含有E988A基因表达的小鼠胚胎存活，而F1后代存活小鼠均鉴定为嵌合体。与之相似，Kamaletdinova等人创建了PARP1低活性的PARP1-ΔC（缺失C端33个氨基酸）小鼠模型， 尽管Parp1+/ΔC小鼠可存活，PARP1-ΔC蛋白的表达水平却较低，而且纯合的Parp1ΔC/ΔC在胚胎发育E8.5天前胚胎致死。若通过成年小鼠中条件性敲除的方式绕过胚胎发育，则PARP1ΔC/-小鼠可存活，但对遗传毒性物质高度敏感。有趣的是，与PARP1-E988A蛋白不同，PARP1-ΔC蛋白并没有被“阻滞”在DNA损伤处。但在Parp1ΔC/ΔC细胞中却观察到了PARP2蛋白的阻滞。

总结与展望

自合成致死效应发现以来， PARP抑制剂的应用获得了极大发展。然而，临床现有的抑制剂均通过与催化口袋结合起作用，策略相似；且并表现出不同的阻滞效果，而阻滞机制尚不明。变构模型虽解决了活性相关模型中活性与阻滞不成正比的矛盾，但仍不完善。PARP1缺陷小鼠模型的出现进一步完善了对PARP1生物学功能的理解，并揭示了现有的PARP抑制策略的风险，和进一步开发新的PARP抑制策略的必要性。变构假说提示了我们新的PARP1抑制策略的可行性。但考虑到PARP1在多种生物过程中的多面性，未来我们仍需谨慎前行。除此之外，PARP1不同自身修饰位点的生物学作用，及PARP2对PARP1功能调节的参与，尚未完全清晰，仍需研究者们进一步的探寻阐明。

1. Shao, Z. et al. (2023) Inactive PARP1 causes embryonic lethality and genome instability in a dominant-negative manner. Proc Natl Acad Sci U S A 120, e2301972120. 10.1073/pnas.2301972120

2. Kamaletdinova, T. et al. (2023) Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 Lacking Enzymatic Activity Is Not Compatible with Mouse Development. Cells 12. 10.3390/cells12162078

论文作者介绍

邵正萍 

研究员

邵正萍，浙江大学“百人计划”研究员，博士生导师。2007年于浙江大学信息工程光电系本科毕业，同年入读浙江大学医学院PhD/MD项目，受国家留学基金委支持，以联合培养博士生身份于美国德克萨斯大学西南医学中心完成博士论文研究，分别于2012年、2014年获得病理学与病理生理学学位及临床医学博士学位。之后于纽约哥伦比亚大学癌症基因组学研究所进行博士后培训。2022年5月起任浙江大学基础医学院病理与病理生理学系 “百人计划” 研究员。致力于采用分子生物学、细胞生物学、小鼠模型研究和生物信息学方法，研究DNA损伤修复和基因组不稳定性在机体发育及肿瘤发生发展中的作用。近年来有多篇研究成果以第一作者身份发表于Nature(2020)、Nucleic Acids Research(2020)、Proceedings Of The National Academy Of Sciences(2023)等期刊。

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