非常规酵母天然产物合成

解脂耶氏酵母 

解脂耶氏酵母属于子囊菌门、酵母菌目、耶氏酵母菌属，被美国食品药品监督管理局认定为一般认可安全微生物，通常存在于乳制品、面包等发酵食品和土壤、海洋及油质污染等生态环境中。解脂耶氏酵母是一种二态型酵母，可以作为圆形多极出芽细胞、假菌丝或带有隔膜菌丝的菌丝体生长，具体形态取决于生长条件。其有较强的环境适应能力，可在高渗透压及较为极端的pH条件(2.5–9.5)下生长，可耐受的最高温度为38 ℃。解脂耶氏酵母生长所需的培养条件简单，底物利用谱广泛。代谢工程改造可进一步拓展解脂耶氏酵母的碳源利用谱，通过理性的人工改造可实现其利用木糖、半乳糖、菊粉、木质纤维素等进行生长及代谢。

解脂耶氏酵母目前已表征了多种内源启动子，组成型启动子包括 PTEF1、PTDH1、PFBA1及PGPM1，诱导型启动子中有许多源自脂质代谢途径，如受油酸诱导的启动子PPOX2、PPOT1和PLIP2，此外还有Cu2+诱导型启动子PMT1-6、赤藓糖醇诱导型启动子PEYK1等，在此基础上也有人工设计的杂合型启动子以实现定制化的基因表达需求。解脂耶氏酵母中诸多转录元件的相继开发及CRISPR介导的调控系统的应用也加速了其遗传操作技术体系的发展，为产物的合成与生产奠定了坚实的基础。

作为天然的产油微生物，解脂耶氏酵母的代谢系统非常适合油脂和脂肪酸的生产，胞内高浓度的脂质含量也为其他疏水性天然产物的合成与储存提供了得天独厚的条件。解脂耶氏酵母是典型的Crabtree阴性酵母，相对于酿酒酵母，其在培养过程中基本不产生乙醇，可以避免发酵过程中乙醇积累对产物的影响，具有很好的工业应用潜力。此外，解脂耶氏酵母胞内有多条乙酰辅酶A合成途径，可为多种产物的合成提供充足的前体。目前，解脂耶氏酵母在脂质、萜类化合物、黄酮化合物等多类天然产物的合成中已得到广泛应用，部分产物产量相当可观。

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 巴斯德毕赤酵母

巴斯德毕赤酵母属于子囊菌门、酵母菌目、Komagataella属。毕赤酵母因其生长密度高、蛋白翻译后修饰适度、蛋白分泌能力强、培养工艺简单等优势，已逐渐成为最为常用的异源蛋白真核表达平台。毕赤酵母被FDA认定为GRAS菌株，并获准用于制药和食品行业。据报道，目前已采用毕赤酵母表达了5000多种蛋白，其中超过70种蛋白产品已经进入市场。作为一种典型的甲基营养型酵母，毕赤酵母能够以甲醇为唯一碳源进行生长，最适生长温度为28–30 ℃，可耐受pH范围为3.0–7.0。

其天然的醇氧化酶启动子PAOX1具有非常高效的启动能力且受甲醇的严格诱导，甲醇诱导培养体系也已发展成为毕赤酵母最常用的发酵生产工艺。除甲醇外，葡萄糖、甘油、乙醇、山梨醇等也是毕赤酵母可用的碳源底物，其相关的各类天然启动子也在毕赤酵母中均有较好的应用，包括强度各异的诱导型启动子及组成型启动子等。基于天然启动子构建的启动子突变文库以及人工设计的合成启动子也进一步丰富了毕赤酵母的转录调控工具库。相比之下，终止子的开发相对有限，目前仍以醇氧化酶终止子 AOX1tt为主。近年来，一些内源性终止子相继被鉴定，且一些外源终止子也被证实可在毕赤酵母中发挥功能。目前，毕赤酵母已有多种商业化的表达载体可供直接使用，如 pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ 系列等。近年来，毕赤酵母中合成生物学工具的开发也取得重要进展，包括 Golden-Gate 组装、Cre-loxP 重组，以及基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑技术等，大大降低了毕赤酵母中途径组装与代谢重构的遗传操作难度。

毕赤酵母在天然产物合成方面主要以聚酮、萜类为主，其他还包括黄酮、多糖以及脂 肪酸衍生物。甲醇、甘油或葡萄糖一般被用作主要的碳源底物，而近年来乙醇也被作为碳源在聚酮及黄酮合成方面表现出了明显优势。此外，强化前体供应、途径区室化、辅因子工程及途径精细调控等代谢工程调控策略也已有较多研究，可以有效促进毕赤酵母中的产物合成。

马克斯克鲁维酵母 

马克斯克鲁维酵母属于子囊菌门、酵母菌目、克鲁维酵母菌属，最初由葡萄中分离获得，其广泛存在于植物和乳制品中，产生的芳香化合物可以为乳制品以及酒类增加特殊风味。马克斯克鲁维酵母不仅是FDA认证的GRAS级别微生物，还通过了欧盟食品安全监督局)的安全认证，在2013年被中国国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料。

马克斯克鲁维酵母独特的生理特性主要体现在耐高温、生长速率高以及具有利用多种碳源的能力。菌株普遍都能在40 ℃条件下生长，生长速率可达0.86–0.99/h，远高于其他酵母，其中部分菌株最高可耐受50 ℃以上的温度。高温发酵可以大幅降低冷却成本及染菌风险，且更利于一些在高温下活性更好的酶进行催化反应。除了葡萄糖以外，马克斯克鲁维酵母还可以利用一些其他糖类作为单一碳源进行生长，包括 果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和菊糖等，因此这些糖类来源的许多廉价农业及食品业副 产物都可以作为其发酵碳源。

许多酿酒酵母来源的启动子都能在马克斯克鲁维酵母中发挥作用，主要以组成型为主。鉴于马克斯克鲁维酵母的耐热特性，一些内源启动子的强度还会受到温度的影响和调控。马克斯克鲁维酵母中天然的同源重组效率很低，实现基因的替换或缺失通常需要 500 bp 以上的同源臂。目前Cre-loxP 以及CRISPR系统都有在马克斯克鲁维酵母中实现 基因敲除的成功应用。天然马克斯克鲁维酵母可以生产苯乙醇以及乙酸乙酯等化合物。通过基因工程改造，马克斯克鲁维酵母还能生产果糖糖浆、虾青素 以及三乙酸内酯等，由于分子操作技术以及相关代谢背景的限制，目前常用的产物提高策略仍以关键基因过表达以及旁路基因的敲除为主。

圆红冬孢酵母 

圆红冬孢酵母、属于担子菌门、锁掷酵母目、红冬孢酵母属，圆红冬孢酵母在自然界中分布广泛，且抗逆性较强，能利用多种工农业废 弃物作为碳源，如粗甘油、木质纤维素水解物、挥发性脂肪酸、甘蔗糖蜜以及稻壳废弃物等。作为有较强油脂累积能力的微生物，其在不同 培养条件下的细胞油脂含量可占干重的20%–79%，是生产食用油脂及生物柴油原料的潜力微生物。此外，红冬孢酵母还被用于合成多种类胡萝卜素、脂肪酸衍生物以及萜类化合物等。2011年至今，已有多株圆红冬孢酵母完成了全基因组测序，随后多组学分析被广泛用于探究其碳源利用、胁迫响应及油脂等的相关代谢。在此基础上，多个研究团队构建完善了圆红冬孢酵母详细的油脂代谢网络，为进一步优化菌株的油脂生产提供了良好的代谢背景基础。传统的化学、物理诱变方法一直是获得高产圆红冬孢酵母菌株的常用方法，经典的代谢工程策略也常结合ATMT应用于提高油脂及类胡萝卜素产量。但是，圆红冬孢酵母本身同源重组效率过低，这很大限制了其在菌 株改造及异源合成方面的发展。随着基因操作技术的发展，近年来多个课题组已成功在红酵母中建立了 CRISPR/Cas9 系统。目前，ATMT以及CRISPR等技术均可在圆红冬孢酵母中实现基因缺失操作，RNAi也能实现基因转录抑制。这些工具的建立进一步促进了圆红冬孢酵母在化合物生产上的开发应用。

来源：《非常规酵母天然产物合成》钱芷兰等