01
摘要
高密度发酵是蛋白质工业生产的关键，需要选择最佳培养基和碳源。P. pastoris是一种甲基营养酵母，在食品和制药工业中已广泛应用。本研究为生产蛋白质创造一个优越的平台，从而为这些领域做出贡献。这项研究使用摇瓶和生物反应器比较了三种野生型菌株，其中两种也分析了它们的二倍体。利用mCherry作为蛋白质模型，研究了葡萄糖和甘油作为碳源。甘油成为首选碳源，与葡萄糖相比，所有菌株的生物量浓度增加了40%以上。值得注意的是，野生型菌株Y-7556在48 h内达到了244 g DCW/L，这是迄今为止报道的最高浓度，突出了P. pastoris高密度发酵的潜力。在蛋白表达方面，二倍体Y-11430在发酵123 h后mCherry蛋白比单倍体高出43%。本研究结果强调了二倍体菌株的优势，优化的发酵培养基和碳源选择，有效地解决了文献中的关键空白。
02
前言
P. pastoris是一种甲基营养酵母，在研究和工业中广泛应用的重组蛋白表达平台。在世界各地已经分离并鉴定了多种P. pastoris菌株。然而，对不同野生型菌株的生长能力的研究却很少。野生型菌株之间在生长速度、对各种碳源的利用、生产乙醇的能力和其他几个参数上存在差异。选择具有最高生长潜力的野生型菌株对项目的成功至关重要。
其中一个特征菌株是NRRL Y-11430。最初，使用亚硝基胍诱变菌株Y-11430，产生组氨酸营养不良物GS115。该菌株因易于通过HIS4互补将异源基因整合到基因组中而受到欢迎。随后，通过将HIS4引入GS115以恢复原生状态，开发了X-33。菌株X-33被认为是一种野生型，广泛用于学术界和工业界。Y-7556菌株因其在科学研究和生物技术应用中的效用而得到认可。
与酿酒酵母一样，P. pastoris是一种子囊菌同源芽殖酵母，能够以单倍体或二倍体存在。P. pastoris通常保持营养单倍体形式的稳定性，除非在特定条件下。细胞内同源染色体组的数量可以改变基因调节、细胞生理学和获得性突变谱。通过对交配和转录水平分析的表型特征描述，研究了P. pastoris交配类型的调控，揭示了P. pastoris MAT基因在交配和孢子化过程中所起的作用。本研究的目的是对三种常见的WT P. pastoris菌株(X-33, NRRL Y-11430, NRRL Y-7556)进行研究，以获得达到150 gDCW/L以上的生物量水平的条件，并首次评估倍性水平对重组蛋白表达的影响。
03
结果
二倍体菌株的产生
高倍体水平与异源重组蛋白表达之间的相关性并不直接，并且在文献中没有明确建立和记录。交配是在特定的培养基上进行的，然后将细胞转移到YPD平板上进行隔离播种。然后，挑选不同的菌落，并在显微镜下检查，以选择看起来更大的细胞。选取体积大于WT细胞的细胞，用流式细胞仪分析。三株WT菌株和可疑交配细胞的显微镜图像如图1所示。成功交配的细胞X-33_MAT1和11430_mat9（图1d和e ）分别比X-33和Y-11430（图1a和b）的细胞大。
接下来，流式细胞评估细胞内的DNA含量。在X-33和Y-11430的单倍体样本中，G2荧光峰包含两个基因组拷贝，与X-33_MAT1和Y-11430_MAT9二倍体样本的G1荧光峰一致（图2），与葡萄球菌菌株的结果相似。这是由于单倍体G2和二倍体G1荧光峰都包含两个基因组拷贝。因此证实了二倍体P. pastoris菌株的成功创建。
摇瓶中生长速率的测定
在摇瓶中使用葡萄糖或甘油作为碳源，以确定最适合的碳源，以实现所有WT单倍体和二倍体菌株的高生物量和快速生长速率。所有菌株在摇瓶中使用两种不同碳源获得的生物量（g DCW/L）如图3a所示。Y-7556在15 h内的生长速度比Y-11430、X-33及其二倍体更快，生物量浓度更高。在前15 h, Y-11430和Y-7556在葡萄糖条件下的生长速度比在甘油条件下快。但在31 h后，甘油使生物量达到较高水平(p < 0.05)。用HPLC测量葡萄糖培养物中的乙醇浓度，如图3b所示。与所有菌株相比，Y-7556在15h后的乙醇浓度最高，可能是由于高生物量。WT X-33在葡萄糖和甘油中生长15 h后达到相同的生物量；24 h后，甘油中生物量显著升高。实验开始49 h后，乙醇和甘油被完全消耗（图3b和c）。Y-7556表现出更高的生物质产量，这意味着在相同的葡萄糖或甘油浓度下获得更高的生物质。
发酵罐中生长速率的测定
所有单倍体菌株均以葡萄糖和甘油为碳源，比较其生长能力。Y-11430、Y-7556和X-33分别在~12 h、11 h和16 h后消耗完初始葡萄糖量。Y-11430在~13.5 h后甘油完全消耗。Y-7556为5h, X-33为18 h。发酵罐内葡萄糖浓度保持在0 ~ 1.5 g/L之间，甘油浓度保持在0 ~ 3g /L之间。浓度越高，碳源的流速越小，反之亦然。所有WT菌株的生长曲线如图4a所示。与葡萄糖相比，以甘油为碳源的所有菌株的生物量产量都比葡萄糖高40%以上。由图4a和表2可知在前23 h，所有菌株都处于生长阶段，所有菌株的甘油产量都高于葡萄糖。与X-33相比，菌株Y-7556和Y-11430的最终生物量浓度更高（表2）。在3.7 L发酵罐中也进行了单倍体和二倍体的比较(图4b和c)。WT Y-11430和二倍体Y-11430_MAT9的生长相似。但X-33_MAT1比WT X-33更快达到最终生物量。
因此，甘油是三种WT菌株以及X-33和Y-11430二倍体菌株生长的首选碳源，生物量浓度提高40%以上。在摇瓶和发酵条件下对三种WT菌株进行了比较。菌株Y-7556和Y-11430优于X-33。甘油是比葡萄糖更受欢迎的碳源。
mCherry表达克隆筛选
mCherry作为一个模型来评估不同菌株的蛋白质生产能力。X-33和NRRL Y-11430克隆成功，但NRRL Y-7556克隆失败。转化后，从每个菌株中选择两个菌落(X-33的mC1和mC8, NRRL Y-11430的mC4和mC8)，在YPG培养基中30℃下接种24 h。X-33克隆在含有100和500 μg/mL Zeocin的培养皿上生长，NRRL Y-11430克隆在含有1000 μg/mL Zeocin的培养皿上生长（图5a）。对于X-33克隆，与X-33_mC1相比，X-33_mC4的颜色偏红（图5b）。因此，X-33_mC1被选中进行进一步的工作。以NRRL Y-11430克隆为例，对酵母进行离心分离，测定培养基的荧光吸光度，激发/发射波长为550/610 nm。Y-11430_mC4和Y-11430_mC8的吸光度相近(~ 95000)，选择Y-11430_mC4。
在YPM培养基上表达mCherry
选择克隆X-33_mC1和Y-11430_mC4及其二倍体，在YPM板上孵育4天后，评估其生长和mCherry产量效率。对Y-11430和X-33菌株的单倍体和二倍体进行菌落大小和荧光强度分析 (图6a)。与X-33菌株相比，Y-11430菌株无论是单倍体还是二倍体，形成了更大的单菌落。如图6b所示，在3D荧光图像中，Y-11430和X-33克隆中二倍体菌株的荧光强度明显高于单倍体菌株，表明更高的mCherry表达。此外，观察到Y-11430克隆比X-33克隆具有更高的荧光强度，进一步证明Y-11430优于X-33的应用潜力
mCherry发酵
通常，通过AOX1调控的P. pastoris培养分为三个阶段：批式培养、补料批式培养和甲醇诱导培养阶段。在分批和饲料分批阶段，甘油被用作碳源。由于X-33生长缓慢，因此在发酵开始70 h后，向发酵罐中添加10 g酵母提取物。每隔几小时测定生物量。直到补料批式培养阶段结束和诱导阶段开始X-33_mC1和Y-11430_mC4克隆的生物量测量结果与WT菌株(图7a和b)相似。在诱导前和诱导过程中收集样品，评估和蛋白质分泌以及荧光测量(图7e和f)。Y-11430_mC4在112 h后产生3381±26 mg/L的蛋白质，比X-33_mC1（1219±15 mg/L）表现更好 (图7c和d)。
从培养基中纯化mCherry
为了证实二倍体作为蛋白质生产者的优势，从发酵液中小规模地纯化了
mCherry。如图8所示，对Y-11430克隆的mCherry纯化和定量实验结果显示，单倍体菌株和二倍体菌株在发酵123 h后mCherry产量有显著差异。单倍体菌株产生1245 mg/L的mCherry，而二倍体菌株产生1784 mg/L，二倍体菌株的mCherry产量增加了约43%。
04
结论
本研究旨在比较三种野生型P. pastoris菌株及其二倍体的生长速度和蛋白质表达能力。野生型菌株Y-7556和Y-11430比X-33生长更快，生物量浓度更高。
本研究成功地生成了P. pastoris菌株的二倍体变体，并展示了二倍体对蛋白质生产的影响。此外，甘油在促进更快的生长和更高的生物量浓度方面优于葡萄糖，超过240 g DCW/L的生物量，为优化P. pastoris在工业中的应用提供了有价值的见解。
05
文章信息
期刊：Current Research in Food Science
DOI：DOI: 10.1016/j.crfs.2024.100840
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39328387/
注意：个人水平有限，文中可能存在错误，准确信息请阅读原为
多多点赞，会变好看
多多留言，会变有钱
多多打赏，生活不丧
