2024年第11期文章推荐 || 基于典型相关分析探究猪精液冷冻前后表观指标的相关性

生猪产业是关系国计民生的重要产业，猪肉是百姓 “菜篮子” 的重要组成。根据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）的统计数据，2023 年全球肉类市场中猪肉的占比约为33%，中国肉类市场中猪肉的占比高达57%。然而，自2018 年非洲猪瘟暴发以来，生猪产业面临了前所未有的挑战。与此同时，地方猪种质资源的保护现状同样令人担忧，尤其是核心种群遭受了显著的冲击[1]。非洲猪瘟导致国内多家祖代猪场清栏，地方猪种质资源面临着种群数量锐减和品种数量减少的双重压力，核心群损失超20%[2]。根据 《中国畜禽遗传资源志·猪志（2011 年版）》 记载，自20 世纪80 年代起，我国地方猪种群数量开始逐渐减少[3]。金华猪在1980 年的统计数据显示有约6.7 万头母猪，而到了2006 年的普查时，仅余约1 万头[4]。截至2021 年，金 华猪的公猪仅剩23头，母猪400 余头[5]。不仅仅是群体数量的锐减，地方猪品种数量也在持续减少，一些地方猪品种将面临灭绝的风险。据2016 年原农业部印发的《全国畜禽遗传资源保护和利用 “十三五” 规划》通知显示：我国地方猪种共有90 个，其中已灭绝的猪种有8 个，濒临灭绝的猪种有5 个。《国家畜禽遗传资源品种名录（2021 年版）》 中列出的地方猪种仅剩下83 个，短短5 年间就有7 个地方猪种消失。核心群的减少对猪的品种改良影响巨大，地方品种的消失更加强了人们对猪种质资源保护重要性的认识。

精液冷冻技术由于成本相对较低且技术成熟被广泛应用于猪的种质资源保存中，该技术在保存优良公猪的精液、建立种质资源库、传播优秀公猪遗传资源方面具有不可替代的作用[6]。该技术可以有效延长精液的保存时间并提高保存效果[7]，然而冷冻过程中猪精子会受到冷冻应激，造成细胞结构严重损伤，导致精子的活力和活率降低，以至于精子的受精能力下降，“受精窗口期” 缩短，国内外冻精配种的生产成绩仍与常温保存存在显著差距[8]。随着人工授精技术在养猪业中的广泛应用，对高质量冻精的需求日益增加。尽管该领域已经取得了广泛的进展，但迄今为止，冷冻保存所涉及的生物和生化机制尚未得到彻底阐明[7]。探究精液冷冻前后表观指标之间的潜在关系可为冻精生产提供建议和决策。

典型相关分析（Canonical Correlation Analy sis，CCA）是一种用于研究2 个变量集之间关系的多变量统计方法[9]。其计算过程首先需要定义两个变量集（X,Y），每个变量集中可以包含多个变量。然后计算每个变量集的协方差矩阵ΣXX 和ΣYY，以及2 个变量集之间的交叉协方差矩阵ΣXY。接下来，通过求解特征值问题来找到线性组合a 和b，使得aTX 和bTY 的相关性最大化。优化目标函数为：

这一步通过标准的特征值和特征向量求解来实现。接着，利用求得的特征向量a 和b，构建典型变量，分别为U=aTX 和V=bTY。在找到第1对典型变量之后，继续求解下1 对典型变量，同时确保新找到的典型变量与之前找到的典型变量正交（不相关），从而得到多个典型变量对。典型相关分析具有多种优点[10]。首先，它能够同时分析2 个变量集之间的复杂关系，最大化它们的相关性，从而揭示2 个变量集之间的潜在关联结构，这在研究多维数据集时尤为重要。其次，通过提取重要的典型变量，CCA 有效地减少了数据维度，同时保留了最大量的信息，这对于处理高维数据集非常有用，能够简化后续的分析步骤。此外，CCA 在多视图学习中应用广泛，能够处理来自不同源的数据（如图像和文本）的关联问题，提供统一的表示形式，有助于融合不同类型的数据。最后，CCA 提供统计检验，评估典型相关对的显著性，从而判断2 个变量集之间的关联是否具有统计意义。这对于验证结果的可靠性和解释性具有重要作用。

因此，本研究旨在采用典型相关分析方法，深入探究猪精液冷冻前后表观指标之间的潜在关联。通过对猪精液冷冻前后的表观指标进行综合分析，以期能够较全面地理解冷冻过程对猪精液质量的影响，为猪冷冻精液的生产和种质资源的保存提出更优的建议和决策。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2023 年5—7 月进行，所有精液来自北京平谷区某猪场，对30 头1～2 岁的健康公猪（法系长白、大白各15 头）的精液分别冻了2～4次，得到有效样本共计76 头次。猪精液冷冻试剂（猪冻精试剂套装，包含精液预稀释液、冷冻液和解冻液，冷冻液包括Ⅰ液和Ⅱ液），所有试剂均按照说明书配制。

主要仪器设备：精液质量分析系统（TYCASA.V1.0）、平衡仪（TYPHY10）、全自动细管灌装封口一体机（TYGZJ-1-50）、程序冷冻仪（TYLDY-900）、大容量离心机（TYLXJ-0-4500）、低温操作柜（TYDWCZG-150）、100 L 自增压液氮罐（BGHN-ZZYG-100）均由北京田园奥瑞生物科技有限公司提供。35 L 液氮罐（金凤）。

1.2 精液冷冻解冻

现采的公猪原精液经过37 ℃预热的预稀释液1∶2 稀释后，用保温泡沫箱在1 h 内运输到实验室。取1 mL 的样品在37 ℃孵育1 min 后，使用CASA 精子分析系统检测精子的密度、活力和活率。其余部分的精液使用平衡仪在70 min 内降温至17 ℃。然后，在17 ℃下使用离心机以850 g的离心力离心13 min，去除上清液。加入冷冻I 液稀释至每毫升20 亿精子，并在平衡仪中继续降温90 min 至4 ℃。加入4 ℃预冷的II 液按1∶1稀释，然后在4 ℃低温柜中使用0.5 mL 细管灌装机进行灌装和封口。灌装后，利用码架将细管排列整齐，使用程序化冷冻仪进行冷冻。冷冻程序如下：首先在2 min 内从4 ℃降温至1 ℃；随后在4.7 min 内迅速降温至-140 ℃；最后在-140 ℃下保持5 min 完成冷冻。冷冻程序结束后，将细管精液用纱布袋装好，浸入液氮中保存。

冷冻结束后第2 天进行精液解冻。解冻程序如下：先在60 ℃的水浴中解冻15 s，然后用37℃预热的解冻液按1∶7 的比例稀释。稀释后，将精液分别在37 ℃条件下孵育10 min 和2 h，并在每个时间段结束后分别检测精子活力（前向运动精子占全部精子的比例）和活率（运动精子占全部精子的比例）。

1.3 精液检测

取10 μL 精液滴到红宝石计数板，盖上盖玻片等30 s 后检测位置相距较远的4 个视野，取平均值。精子分析系统（TYCASA.V 1.0）的所有参数均为系统默认值。

1.4 数据处理与分析

由于放置2 h 后有精子出现凝集和破碎等现象，导致检测的精子密度降低，实测精子活力和活率偏高，因此使用密度对表观活力和表观活率进行校正。2 h 校正活力（活率）=2 h 实测活力（活率）×2 h 密度/10 min 密度。

对各性状相关数据用Exce1 2019 进行整理并计算，用SPSS 22.0 统计软件对原始数据进行典型相关分析。对典型相关分析模型的解释能力有两种衡量方法：一是典型相关系数的共享方差，即典型相关系数的平方；二是冗余分析，包括对典型变量组内代表比例和冗余指数的分析。组内代表比例是典型变量对本组变量方差的解释比例。冗余指数，又称交叉解释比例，是典型变量对另一组变量方差的解释比例。

2 结果

2.1 猪精液冷冻前后表观指标结果

由表1 可知，试验所选用种猪精液冻前密度的变异系数达到了42.14%，样品的覆盖较全面。

表1 猪精液冷冻前后表观数据的统计分析
Table 1 Statistical analysis of phenological data before and after freezing of porcine semen

2.2 指标相关性

猪精液冷冻前后表观指标的相关性如表2 所示，X1 与X2 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.686。X1 与X3 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.578。X2 与X3 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.351。Y1 与Y2 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.946。Y1与Y3 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.531。

表2 冷冻前后表观指标的相关系数矩阵
Table 2 Matrix of correlation coefficients of apparent indicators before and after freezing

注：同列数字肩标* 表示差异显著（P＜0.05）、肩标** 表示差异极显著（P＜0.01），无标记表示差异不显著(P＞0.05)
Note:Figures in the same column are marked with*to indicate a significant difference(P ＜0.05),**to indicate a highly significant difference(P ＜0.01),and unmarked to indicate a non-significant difference(P ＞0.05).

X1 与Y2 呈显著正相关（P＜0.05），相关系数为0.237。X2 与Y1 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.491。X2 与Y2 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.538。X2 与Y4 呈显著正相关（P＜0.05），相关系数为0.231。X2 与Y5呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.338。

2.3 典型相关系数及检验

典型相关系数及其检验结果计算结果如表3所示。共提取了3 对典型相关变量，其载荷系数分别是0.639、0.580 和0.105，但是，根据相伴概率低于0.05 的要求，只有前2 对典型变量具有统计显著性。因此，通过分析前两对典型变量的相关性即可分析出猪精液冷冻前与冷冻后表观指标之间的相关性。

表3 典型相关系数与检验值
Table 3 Typical correlation coefficients and test values

2.4 典型相关模型

典型相关系数表示原始变量在提取的典型变量表达式中的重要性程度，考虑到原始变量存在计量单位的差异，本文采用标准化的典型系数。

典型相关方程1：

典型相关方程2：

（1）在第一组典型相关方程中，观察到以下关键载荷：在U1 中，冻前预稀释活率（X2）具有显著载荷（1.189），表明其与U1 的相关性较高。表明猪精液在冷冻前的预稀释活率对于U1 的影响较大。而在V1 中，解冻后10 min 平均活力（Y1）和解冻后2 h 平均校正活力（Y3）的载荷较大，分别为-93.574 和-117.508，表明它们与V1 的相关性较高。

（2）在第二组典型相关方程中，观察到以下关键载荷：在U2 中，冻前预稀释活力（X1）和冻前预稀释活率（X2）的载荷较大，分别为0.387和0.388。表明猪精液冷冻前的活力和活率对U2的影响。而在V2 中，解冻后10 min 平均活力（Y1）和解冻后2 h 平均校正活力（Y3）的载荷较大，分别为-264.086 和-340.631。表明猪精液冷冻后的活力表现与V2 的相关性较高。

2.5 典型结构分析

典型结构分析反映原始变量对典型变量的影响程度和方向，计算结果如表4 所示。由表4 可以得知，冻前预稀释活率（X2）对第一组典型变量（U1 和V1）的载荷较大，分别为-0.915 和-0.584。这表明冻前预稀释活率与冷冻前后的猪精液活力和活率变化之间存在较高程度的负相关性。对于第一组典型变量，冻前预稀释活力（X1）和原精密度（X3）的负载荷分别为-0.442和-0.458，表明它们与冷冻前后的猪精液指标变化有一定的负相关性。对于第二组典型变量（U2和V2），解冻后10 min 平均活力（Y1）、解冻后2 h 平均校正活力（Y3）和解冻后10 min 与2 h的平均活力（Y5）与U2、V2 的相关性较高，表明这些变量与猪精液冷冻后的指标变化有较强的关联。

表4 典型结构分析
Table 4 Typical structural analysis

注：U1 和V1 为冷冻前指标的第一典型变量；U2 和V2 为冷冻前指标的第二典型变量。
Note:U1 and V1 are the first typical variables of pre-freezing indexes;U2 and V2 are the second typical variables of the pre-freezing index.

2.6 典型冗余分析与解释能力

变量的标准化方差结果如表5 所示。从典型相关系数的平方来看，这两组典型变量的解释能力都较强。在第1 组中，有40.8%的信息能够被第2 组的变量所解释，第2 组中比例为33.6%，累计贡献率达74.4%。

表5 共享方差与冗余分析
Table 5 Shared variance and redundancy analysis

注：σ2UU 和σ2VV 分别表示猪精液冷冻前表观指标和猪精液冷冻后表观指标的方差；σ2UV 和σ2VU 分别表示猪精液冷冻前表观指标和猪精液冷冻后表观指标之间的协方差。
Note:σ2UU and σ2VV:denote the covariance between pre-freezing epigenetic indicators of porcine semen and post-freezing epigenetic indicators of porcine semen,respectively.σ2UV and σ2VU: denote the covariance between the pre-freezing phenological indicators of porcine semen and the post-freezing phenological indicators of porcine semen,respectively.

3 讨论

典型相关分析是一种强大的多变量统计方法，被广泛应用于多个学术领域，以揭示两个变量集之间的复杂关系。该方法在畜牧兽医领域逐渐引起重视，王孝义等[11]利用典型相关分析探究了猪生长性状与胴体性状的内在关系。道勒玛等[12]通过典型相关分析探究了阿拉善双峰驼血清激素水平与泌乳性能的相关性。谭玉文等[13]对宁都黄公鸡生长、体尺、屠宰的3 组数据共20个指标进行了典型相关分析，发现生长性状与体尺性状、生长性状与屠宰性状、体尺性状与屠宰性状存在极显著的相关性，典型相关分析比简单相关分析能更准确、全面地反映性状间的相关关系。典型相关分析还被用于探究AA 肉鸡体尺性状与屠宰性状的相关性、AA 肉鸡饲养环境与生产性能间的相关性[14,15]。

从本研究的描述统计结果看，猪精液冷冻前表观指标的变异程度都较大，试验中的猪新鲜精液均来自同一个种猪场，可能是由于个体差异或采精技术差异导致的，其中冻前精液密度的变异系数达到了42.09%，也说明本次试验的数据涵盖了差异较大的不同样本，代表性较好。预稀释活力平均为54.33，比解冻10 min 活力57.86 更低，这是由于预稀释的稀释液和解冻液配方不同，预稀释液对精子前向运动存在一定程度的抑制作用，但能降低精子在17 ℃降温平衡和离心时的氧化损伤。并且由于稀释比例小，预稀释后精子密度仍然较大，精子之间的频繁碰撞会改变精子轨迹，从而影响精子前向运动[16]。

由于所有的原精都用同一种稀释液稀释，因此稀释后的活率和活力可以反映原精质量。而冻精解冻液和解冻程序都相同，解冻后活力和活率也可以反映冻精的质量。两两相关分析时，冻前指标与冻后指标之间最大相关系数只有0.538，相应的决定系数只有0.289，而第一、二典型相关系数则分别达到了0.639 和0.580，相应的共享方差达到了0.408、0.336，说明冻前指标对冻后指标的综合影响比任何单一指标的都大。第一典型相关的共享方差达到0.408，说明原精质量对冻精质量的贡献比例可以达到40.8%，因此在提高冻精质量时保证原精质量是非常重要的措施。本实验使用到的精液质量指标较少，主要是生产中最容易获得的活力、活率和密度数据，在检测畸形率、DNA 完整率、质膜完整性和线粒体膜电位等更多指标的情形下，可以获得更多精液质量的信息，有可能更好地在冻前预测冻后结果。

Kunavongkrit 等[17]总结了不同环境条件下公猪的管理和精子生产，发现猪的精液受到热应激、光照周期和强度以及营养的影响。众所周知高温会对精子产生不利影响，环境温度过高会对精液质量产生负面影响，如精子活力和正常精子的百分比下降等现象[18,19]。公猪精液采集后的温度管理也同样重要，研究发现37 ℃保存的精子活率、活力和质膜完整性显著低于17 和22 ℃[20]。此外，品种和个体差异及精液的采集技术和频率也会影响猪的精液质量；马国剑等[21]研究了不同品种对公猪精液品质的影响，发现杜洛克公猪的精子密度显著高于其他品种，大白公猪的精子密度显著低于其他品种。其中采精频率是人为可控的重要因素，研究发现公猪在采精间隔4～5 d 时具有较优的精液品质，采精间隔过短会显著降低精液体积、精液密度、精子活力以及有效精子数[22,23]。若采精频率过高，精子活力会显著峰低，其原因可能是精子长时间储存会导致精子活力降低及畸形率升高[23]。所以在采精前加强公猪的饲养管理，做好采精和采精后的保存工作获得更高品质的原精，对冻精生产至关重要。

范振港等[24]总结了猪精液冷冻过程中影响精子活力的关键因素，包括猪精液冷冻稀释液和冷冻保护剂、猪精液冻前平衡、冷却速度和猪冷冻精液解冻。在精液冷冻前需要对新鲜精液进行稀释，稀释液体系的不同会影响其精液冷冻后的活力，市面上常见的猪精液冷冻稀释液有乳糖-蛋黄体系和贝尔茨维尔体系[25]。在精液稀释时又分为一步稀释法和两步稀释法，其中两步稀释法会在稀释Ⅱ液中添加冷冻保护剂（甘油、蛋黄等物质），添加不同冷冻保护剂也会影响冷冻后的活力[26]。稀释后的猪精液在冷冻前还需要进行较长时间的缓慢降温平衡，降温平衡过程可通过维持质膜的脂质结构来增加精子的冷冻耐受性，提高猪精液冷冻效果[27]。使用不含甘油的乳糖-蛋黄体系稀释的精液，4～5 ℃下平衡4 h 效果更佳[28,29]。在程序化冷冻精液生产中，程序化降温速率对精液质量存在较大的影响，人们在进行冷冻时选择的降温曲线有所不同，采用0.5 mL 细管进行程序化冷冻时，推荐使用20、40 或60 ℃/min的降温速率[30]。此外，对冻精进行解冻时的一系列操作和试剂都会影响其精子质量。然而，解冻剂种类较多且成分各不相同，对解冻时间和温度的规定也没有统一的标准，不同的解冻剂、解冻时间和温度都会对解冻效果产生影响。在其他冷冻试剂和冷冻解冻工艺条件下，原精质量对冻精质量的影响有多大还需要更多的研究探讨。

4 结论

本研究利用典型相关分析，综合了3 个冻前精液质量指标（预稀释活力、预稀释活力和原精密度）和5 个冻后精液质量指标，通过该方法，冻前精液质量指标与冻后精液指标之间的相关性由简单相关的最高0.538 提高到综合指标U1 与V1之间的0.639，表明典型相关分析能够较好地利用冻前精液指标预测冻后精液质量。

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