实验步骤：
1.PCR目的基因片段（如已有目的基因片段可忽略）：
选择细胞提RNA,逆转录成cDNA，根据PCR酶配置相应体系进行PCR，得到相应的目的基因片段，同时跑琼脂糖凝胶进行酶切鉴定，根据目的基因的片段大小判断条带应该出现的位置，根据位置判断酶切目的基因片段是否成功。
2.双酶切目的基因：
酶切位点选择和过表达载体相同的酶切位点，常见酶切体系如下：
37℃酶切1h。
3.双酶切过表达载体（以常见的过表达载体plvx-IRES-neo为例）：
选择和目的基因片段相同的酶切位点，以相同条件进行酶切，酶切完成后需跑琼脂糖凝胶鉴定载体酶切是否成功，同时进行胶回收并测定相应浓度。
4.酶切后载体与目的基因连接：
常见连接体系如下：
16℃连接4 h或过夜，连接完成后产物可暂存于冰箱4℃。
5.连接产物转化、摇菌、测序：
连接产物转化摇菌及提质粒均按常规步骤操作即可，质粒提取结束根据浓度取一定微升的原液送公司测序，查看载体构建是否成功。
注意事项：
1.上述步骤中涉及多次琼脂糖凝胶鉴定，配置琼脂糖凝胶时遵循目的基因片段越长，胶浓度约低的原则，目的基因及载体片段大小应提前进行查询。
2.PCR目的基因片段时，应提前设计好相应引物，我所使用的酶为KOD酶，根据说明书配置体系即可。
3.目的基因及载体的双酶切位点可从文献中查询或听取导师意见，酶缓冲液的选择可在NEB官网中进行查询，同时酶切时间及条件由内切酶自身决定。
4.连接过程中我所举例的酶为T4连接酶，连接酶的选择根据自身条件决定，但需注意选择用哪个公司的连接酶，其缓冲液应配套使用，防止降低连接效率，同时加样量并不固定，实验开始前需仔细进行计算。
5.在配置酶切及连接体系时酶应在最后加，实验开始前应混匀。
本文作者是"呜哇呜"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：呜哇呜
校对：煲仔饭
素材：
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