细胞内一氧化氮（NO）是一种在细胞内由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成小分子气体，通常有三种亚型包括神经型（nNOS）、诱导型（iNOS）和内皮型（eNOS）。nNOS和eNOS在生理条件下通常会产生少量的NO维持正常的生理功能，比如在血管内皮细胞调节血管张力等的作用。![]()
另外，iNOS在炎症等病理刺激下可大量产生NO；在巨噬细胞炎症模型中NO具有杀菌作用，因此在一些因素导致的炎症反应中我们通常会检测iNOS或者NO的含量作为细胞表型变化的指标之一，但因iNOS的变化不明显通常检测NO的含量。1、荧光探针法：常用的荧光探针有DAF-FMDA等。（1）原理：DAF-FMDA本身没有荧光，进入细胞后被细胞内酯酶水解生成具有荧光特性的DAF-FM。在有NO存在时，DAF-FM会与NO反应生成具有更强荧光的三唑荧光产物，通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光分光光度计等仪器检测荧光强度，从而反映细胞内NO的水平。（2）优点：灵敏度较高，能够实时检测细胞内NO的动态变化；对细胞损伤较小。（3）缺点：一些细胞内物质可能会对荧光探针产生干扰，影响检测结果的准确性。（1）原理：利用NO与臭氧（O₃）反应生成激发态的NO₂，当激发态的NO₂回到基态时会发出特定波长的光，通过化学发光检测仪测量光强度来定量NO。（2）优点：具有较高的灵敏度和特异性，能够检测极低浓度的NO。（3）缺点：仪器设备较为昂贵，操作相对复杂，且需要对样本进行特殊处理。（1）原理：例如使用Griess试剂，NO在体内或体外被氧化生成硝酸盐（NO₃⁻）和亚硝酸盐（NO₂⁻），Griess试剂可与亚硝酸盐反应生成有色化合物，通过分光光度计在特定波长下测量吸光度来定量亚硝酸盐，进而间接反映NO的水平。（3）缺点：只能检测NO的氧化产物，不能直接检测NO本身，而且检测的是NO的累积量，无法反映实时的NO水平。在这里我们主要介绍一下快速简便的比色法检测细胞内NO的实验步骤：（1）从冰箱取出试剂盒使回复室温；试剂盒中包含1M NaNO2、Griess Reagent I和II三种试剂。（2）用RPMI 1640+10%血清FBS稀释标准品(1-100μM)，标准品的浓度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μM。- 稀释100×：990μL RPMI 1640+FBS+10μL 1M NaNO2(1mL 10mM NaNO2)
- 稀释100×：15μL 10Mm NaNO2+1485μL RPMI 1640(1.5mL 100μM NaNO2)
以下浓度用1.5mL 100μM NaNO2进行稀释：![]()
（3）待测样品处理，吸取细胞培养上清至1.5ml离心管中，12000×g，5min去除细胞碎片和其他沉淀物。（4）按50μl /孔，在96孔板中加入标准品及样品。（5）按50μl/孔，在各孔中加入室温Griess Reagent I。（6）按50μl /孔，各孔中加入室温Griess Reagent II。![]()
图1 标准品加入Griess Reagent I、Griess Reagent II孵育后![]()
图2 样品加入Griess Reagent I、Griess Reagent II孵育后（8）根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮NO的浓度。标准曲线示例如下图：![]()
（9）利用制备的标准曲线计算出待测样本（细胞上清）中NO 的含量：1）利用EXCEL将得到标准品的OD值绘制标准曲线，获取的标准曲线的R2要求在0.99以上，否则需要重新制备标准品样本进行检测；2）计算待测样品NO的浓度，要求测得吸光度的值在标准曲线OD值范围内，否则需要重新制备样品进行检测；3）计算X(NO浓度)：代入公式X=（Y(待测样品吸光度值)-B）/A4）结果分析：理论上，所测OD值与待测样本NO的 浓度成正比。其中在标准曲线范围内，OD值越大，样品产生的NO浓度越高，NO浓度也高显色越深，相反颜色越浅。1、试剂的纯度要高，且在有效期内使用，避免因试剂变质影响实验结果。实验用水应为去离子水或超纯水，以防止水中的杂质干扰实验。2、加入试剂的量要准确，且充分混匀，以保证反应的充分性和一致性。3、及时用酶标仪检测，控制在5min之内。显色反应的温度和时间要严格控制，不同的显色反应有其适宜的温度和时间范围，应根据具体的实验方法进行调整。4、进行多次平行实验，以提高实验结果的准确性和可靠性，并计算平均值和标准偏差等统计参数。5、设置空白对照，即在不加样品的情况下，按照相同的实验步骤进行操作，以消除实验系统自身带来的误差等。6、检测结果应在标准曲线的线性范围内，若超出范围，需对样品进行适当稀释或浓缩后重新测定。7、分开加样进入96孔板时需要主要不要产生气泡，产生气泡时我们可以使用热吹风机短时间消除，轻轻震动板子混匀样品盒试剂。
本文作者是"旺旺仙贝"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：旺旺仙贝
校对：煲仔饭
素材：
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