我国结直肠癌发病率在全部恶性肿瘤中位居第 2 位，死亡率逐年攀升至第 4 位；其中 2022 年新发病例 51.71 万，死亡病例 24.00 万。结直肠癌患者中约 70% 为散发病例，整个发展过程一般历时 5～10 年，早期结直肠癌症状隐匿，不易察觉，多数患者在就诊时已属于中晚期。
中晚期患者常见症状包括：（1）排便习惯改变；（2）粪便性状改变（变细、血便、 黏液便等）；（3）腹痛或腹部不适；（4）腹部包块；（5）肠梗阻；（6）全身症状：如贫血、消瘦、乏力、低热等，晚期可以出现腰骶部疼痛、黄疸、腹水等。
据统计，经规范治疗的确诊结直肠癌患者，5 年生存率接近 64%。此外，结直肠癌预后与诊断分期高度相关，TNM I 期结直肠癌患者 5 年生存率可达 90% 以上，而 TNM IV 期仅有 12% 左右。可见，结直肠癌筛查可以有效降低结直肠癌的死亡率。
人体血液和粪便中的 DNA 检测是一种新兴的结直肠癌筛查方法，具有采样简便，风险小，敏感性和特异性高等优势，有望成为下一代新型结直肠癌筛查和早期诊断检测靶标。
粪便 DNA 检测
粪便 DNA 检测的主要原理，是通过从粪便样本中检测来自脱落肿瘤细胞的标志性 DNA 片段，判断是否存在结直肠癌或癌前病变。这些 DNA 片段主要包括突变 DNA（基因）和 DNA 甲基化。
DNA 甲基化
甲基化修饰是基因表达调控的重要方式，一些异常 DNA 甲基化与结直肠癌发生密切相关：粪便 SFRP2 甲基化检测筛查结直肠癌的敏感性和特异性分别为 77%～90% 和 77%，AUC 为 0.94；粪便波形蛋白甲基化检测筛查结直肠癌的敏感性和特异性分别为 46% 和 90%。
目前，已发现众多有望用于通过粪便筛查结直肠癌的甲基化 DNA，包括 APC、ATM、MLH1、MGMT、BMP3、GSTP1、NDRG4、RASSF2A、SFRP2、TFPI2、HLTF、CDKN2A、GATA4、VIM 和 WIF1 等。
DNA 突变
在肿瘤组织标本中检测结直肠癌相关 DNA 突变已广泛开展。例如，KRAS 是由 RAS 家族成员基因编码的 GTP 酶蛋白，参与表皮生长因子受体（EGFR）的信号转导，调控细胞生长、分化、增殖和存活，被认为是结直肠癌发生的主要驱动基因之一。中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌专家委员会指出，RAS 突变型的晚期结直肠癌患者无法从抗 EGFR 单抗治疗中获益，故推荐对所有晚期结直肠癌患者，在综合治疗前进行 RAS 突变检测。自从 1992 年 Sidransky 等在粪便中成功检测出突变型 KRAS DNA 后，P53、APC、DCC 和 BAT26 等结直肠癌相关突变 DNA 的粪便检测被陆续报道。
遗憾的是，仅 40%～50% 的结直肠癌患者存在 KRAS 点突变；P53 突变一般是结直肠癌的中晚期分子生物学事件，不适用于筛查和早期诊断；APC 基因突变虽然存在于超过 85% 的结直肠癌患者肿瘤组织中，但其诊断结直肠癌的灵敏性相对有限（14%～30%）。这说明单独检测这些突变 DNA 不足以筛查结直肠癌。
多靶标粪便 DNA 检测
结直肠癌的发生是多步骤、多基因驱动的结果，并非每一例结直肠癌均具备上述各突变 DNA 或者甲基化 DNA。多靶标粪便 DNA 检测（multitarget stool DNA test，MT-sDNA）是检测粪便中的多个 DNA 标记，包括甲基化的 BMP3、NDRG4 和突变的 KRAS，并以 βeta-actin 作为内参，具有较好的灵敏性。检出率高、无需肠道准备等优势，使 MT-sDNA 成为未来结直肠癌筛查发展的新方向。
早在千禧年伊始，Ahlquist 等首次报道联合应用 APC、K-RAS、P53 和微卫星不稳定的标志物 Bat⁃26 的多靶标粪便 DNA 检测结直肠癌和直径大于 1 cm 腺瘤的敏感度分别为 91% 和 82%，远高于粪便单靶标 DNA 检测。
有报道称，对于大于 1 cm 的无蒂锯齿状息肉，MT-sDNA 的检出率为 67%，粪便隐血免疫化学检测（FIT）的检出率为11%；对于结直肠癌，MT-sDNA 的检出率为 100%，而 FIT的检出率为 80%。
今年 4 月，一项纳入 2 万多名受试者的研究报告称，联合粪便异常甲基化 LASS4、LRRC4 和 PPP2R5C 检测和免疫化学检测的新一代多靶标粪便 DNA 检测（BLUE-C），检测结直肠癌的灵敏性达到了 93.9%，其中，对 I～III 期结直肠癌的灵敏性也达到了 92.7%，对高级别上皮内瘤变的灵敏性为 74.6%，对癌前病变的灵敏性也达到了 43.4%，各项数据均优于 FIT。
相比于 FIT 而言，MT-sDNA 对结直肠癌和较大腺瘤具有较高的灵敏性，且不需要饮食限制或肠道准备。
尽管若此，粪便 DNA 检测用于结直肠癌的筛查仍面临诸多挑战，其中包括但不限于：
1、特异性未达到预期：FIT 筛查结直肠癌的特异性为 94.8%，而 MT⁃sDNA 检测筛查结直肠癌的特异性为 86.6%；
2、癌前病变检出率仍较然偏低，仅为 42%；
3、检测成本较高，降低了患者依从性；
4、粪便 DNA 大多来自肠道细菌，急迫需要更高效的提取和纯化人类 DNA 的方法；
5、粪便 DNA 的收集较为复杂，样本的处理和分析需要专业的设备与人员，基层难以开展。
血液 DNA / 循环肿瘤 DNA 检测
临床上，外周血是用于结直肠癌分子标志物检测的重要标本。除传统的 CEA、CA199 等结直肠癌相关抗原外，循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）受到广泛关注。游离于血液中的细胞外 DNA 称为 cfDNA（cell free DNA），主要来源于血细胞和肿瘤细胞坏死、凋亡、溶解释放或直接分泌的片段化 DNA，其中来自肿瘤细胞的部分称为 ctDNA，部分 ctDNA 具有肿瘤特异性，可用于结直肠癌的筛查和复发预测，并为术前新辅助治疗及术后辅助治疗的疗效评估提供参考。
同粪便 DNA 检测一样，ctDNA 检测靶标也包括甲基化 DNA 和突变 DNA。其中，参与调控细胞周期和细胞分裂的 Septin9 的异常甲基化是研究报道最多的靶标。血液 Septin9 基因甲基化对结直肠癌的灵敏性为 48.2%～95.6%，特异性为 79.1%～99.1%，对腺瘤筛查的灵敏性为 9.8%～22%。美国 FDA 已于 2016 年批准一种基于血液样本的 Septin9 基因甲基化试剂盒上市。
除 Septin9 的异常甲基化外，ALX4、APC、SFRP2、SDC2、BCAT1、IKZF1 和 SPG20 的甲基化，KRAS、TP53、APC、BRAF 等突变 DNA 也可在患者的血液中被检出，但用于结直肠癌筛查的表现并不突出。
此外，采用多个 DNA 靶点联合检测的方法，可进一步提高结直肠癌 ctDNA 筛查的有效性。例如，使用 C9orf50、KCNQ5 及 CLIP4 基因甲基化联合筛查结直肠癌的灵敏性和特异性分别为 85% 和 99%，对早期结直肠癌诊断灵敏性也达到了 80% 和 85%。联合 ctDNA 检测与粪便 DNA 检测也在结直肠癌的早期筛查中展示出巨大的发展潜力，例如，对于结直肠癌 0～I 期的患者，单独检测血浆 Septin9 甲基化的灵敏性仅为 57%～64%，将血浆 Septin9 甲基化检测与 FIT 联合可将灵敏性提高到 94%。
ctDNA 检测属于微创性操作，采样方便快捷、风险较小，有助于提升人群筛查参与率和依从性。尽管如此，ctDNA 检测仍存在较多问题和挑战，包括但不限于：
1、ctDNA 仅占 cfDNA 的很小一部分，分离和纯化 ctDNA 具有一定难度；检测结果会受到正常血细胞来源的 DNA 的干扰；
2、室温下，ctDNA 在血液中的半衰期仅为 1.0～2.4 h，这对标本的取样、制备和存储提出了较高要求。
附表：部分结直肠癌筛查方式的比较
总结
粪便和血液 DNA 检测作为新颖的无（微）创筛查手段，在结直肠癌的筛查中展现出了巨大的应用价值。基于血液样本的 Septin9 基因甲基化试剂盒和基于粪便样本的多靶标 MT-sDNA（KRAS、NDRG4 和 BMP3）DNA 检测技术已被美国 FDA 批准。《中国结直肠癌诊疗规范（2023版）》也明确提出：近年来粪便 DNA 检测可以进一步提高结直肠癌粪便初筛的效益。相较于单一 DNA 靶标检测，多 DNA 靶标检测可以显著提高灵敏性，而进一步联合 DNA 检测与其它检测（例如 FIT、循环肿瘤抗原等）也极具前景。随着对结直肠癌相关 DNA 的研究更加深入，粪便和血液 DNA 检测有望加速进入临床，为国民健康保驾护航。
