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消化道恶性肿瘤如何治疗？最新研究告诉你！

学术   2024-10-29 20:30   上海  

消化道恶性肿瘤具有异质性，为患者的诊治以及新药的开发带来重重困难。在近期举办的 2024 年欧洲欧洲消化疾病周上，多位学者汇报了消化道肿瘤的机制、诊断、治疗等多个方面的最新研究进展，以期提高相关疾病的诊疗效率。现整理主要内容，以供参考。



患者来源类器官

可用于评估胰腺癌患者的药物治疗反应


胰腺癌具有侵袭性以及高度异质性，因此不同患者的治疗反应有很大差异。患者来源类器官（PDO）可以从不同类型的人体肿瘤中生成，为研究肿瘤异质性和空间组织提供了重要的模型，亦具有预测患者治疗反应的潜力，为个体化医疗提供了强有力的支持。来自德国的乌尔姆大学医院的 Menar Ekizce 等研究者在胰腺癌患者中，评估了 POD 用于患者治疗反应预测和了解肿瘤进展过程的作用。
研究者从未经治疗或经过治疗的胰腺癌患者原发肿瘤和转移灶肿瘤样本中提取组织，经过处理后，培养形成类器官，建立起一个包括 ＞ 100 个 POD 的活体样本库，并在此基础上构建了一个药物分型指导预测模型。此前（2021年）研究者以进行了可行性探索，本研究在41例患者中验证该模型的准确性。
图 1 胰腺癌 PDO 样本库的构建和可行性验证
结果显示，41 例患者的实际化疗反应与药物分型指导相匹配，总体准确性为 80.0%，敏感性为 89.3%，特异性为 64.7%。在既往未经治疗的患者中，一线和二线方案的预测准确率达到 85.7%，但在经过治疗的患者中模型的预测能力较低，对后续化疗的预测准确率为 58.3%。通过使用自动移液系统以及将筛选缩小化对模型进行了改进，显著缩短了药物分型前的时间，并增加了模型预测第二批获批的靶向药物清单的能力，预测准确率约为 70%。临床随访数据显示，使用预测为“有效”的药物治疗的患者无进展生存期更长。
研究者在两个不同的时间点从同一患者中获得了 6 对 PDO，随后进行药物分型和全外显子组测序（WES），获取了治疗期间的完整遗传图谱，揭示了细胞周期检测点激酶 2（CHEK2）基因的患者随着时间的推移对多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂维持治疗的反应，与基于 PDO 的模型预测的结果一致，证实了该模型的可靠性。
研究者利用 POD 活体样本库，采用单核多组学测序技术，获取了对化疗有反应和无反应的胰腺癌 POD转录组和染色质，并深入研究了一例案例随时间的变化。
图 2 一例案例不同时间的多组学分析结果
总而言之，Menar Ekizce 介绍了一个基于 PDO 的治疗反应预测模型，可用于助力肿瘤精准医疗。



CSA凝集素可用于区分海绵胶囊的取样是否充足



海绵胶囊是一种小型、易于吞咽的微型装置，可以在食道和胃中适度膨胀充盈，海绵膨胀后可收集残留细胞样本，将细胞样本固定并进行组织病理学检查，可用于早期筛查食道和胃部可能出现的癌变。在具有反流症状的患者中，使用海绵胶囊可提高Barrett’s 食管的检出率。

图 3 海绵胶囊的工作原理和工作过程
但在实际应用时，在组织病理学检查后发现约有 8% 的患者存在海绵获取细胞样本不充分的的情况，往往需要让患者重新回到医院进行检查，增加了时间成本及检查费用。来自英国剑桥大学的 Alexander Bartram 等研究者设计了一种可以用于判断海绵是否采样充分的新方法， 利用采样后的海绵胶囊中的无细胞液体部分（含有分泌蛋白和糖蛋白），验证新的凝集素生物标志物是否可以区分已经到达胃内的样本（采样充足）与未到达胃内的样本（采样不足）。
图 4 研究设计和原理
研究者采用免疫荧光染色法，用 20 种不同的异硫氰酸荧光素标记的凝集素（每种凝集素可结合特定的碳水化合物），对 5 例患者的正常食管（NE）、巴雷特食管（BE）和贲门（GC）部位的内镜活检样本进行筛选。
结果显示，金雀花（Cytisus scoparius，CSA）凝集素和花生凝集素（Peanut Agglutinin，PNA）优先结合 GC 组织样品，主要结合于柱状上皮的顶端粘蛋白帽和凹细胞。
研究者开发出一种直接酶联凝集素测定（ELLA）方法，使用辣根过氧化物酶（HRP）标记 CSA 凝集素和 PNA，在 126 例液体样本（18 例采样不足，108 例采样充足）中，探究优化过的凝集素是否可以在海绵样品的液体部分检测到生物标志物。
结果显示，HRP 标记的 CSA 凝集素和 PNA 成功结合到海绵胶囊样品的液体部分中。使用 CSA 凝集素对采样充足和采样不足进行区分，ROC 曲线下面积为 0.9522（95% CI 0.88～1.0，p < 0.0001），灵敏度为 87.96%（95% CI 80.49～92.83%），特异度为 94.44%（95% CI 74.24～99.72%）。使用 PNA 对采样充足和采样不足进行区分，ROC 曲线下面积为 0.801，灵敏度为 68.87%（95% CI  59.5～76.89%），特异度为 94.44%（95% CI 74.24～99.72%）。
总而言之，Alexander Bartram 等的研究成功验证 CSA 凝集素可准确区分海绵胶囊的取样是否充足，可以降低整体患者召回率，优化实验室处理流程并降低检查成本。



靶向Hh信号通路可抑制胆管癌细胞



胆管癌（CCA）是一种起源于胆管的恶性肿瘤，具有高度异质性。数十年来，CCA 的发病率和死亡率在全球范围内急剧上升，患者一般确诊较晚、对化疗的反应差、缺乏明确的靶向治疗方案，因此 CCA 的预后极差（5 年生存率 < 20%）。
CCA 最重要的病理生物学特征之一是肿瘤间和肿瘤内的高度异质性，这种高度异质性限制了生物标志物和新型治疗方案的发现，阻碍了早期诊断和有效治疗工具的开发，并对患者的预后产生不利影响。
根据肿瘤发生的解剖学位置，CCA 分为肝内（iCCA）、肝门周围（pCCA）和远端（dCCA）三种类型；根据肿瘤的组织学特征，CCA 分为小胆管型和大胆管型，其中大胆管型类似 pCCA 和 dCCA，而目前尚无分子特征与 iCCA 亚型之间相关性的数据。
来自意大利罗马大学的 Savino Paradiso 指出，Hedgehog（Hh）信号通路是参与 iCCA 发病的分子网络之一，在肿瘤生长、存活、迁移、肿瘤干细胞活化和上皮-间充质转化等多种 iCCA 特征过程中发挥重要作用，因此靶向 Hh 信号通路可能是治疗 iCCA 的潜在方法。GlaB 是一种新型天然化合物，可特异性抑制Hh信号通路下游的转录因子 Gli1。Savino Paradiso 等研究者进行了体外实验，在原代和已建立的细胞系中评估了 GlaB 的作用特点以及对 iCCA 细胞的影响。
图 5 研究示意图
主要的测试方法包括：
  1. 锥虫蓝拒染法，检测游离 GlaB 和透明质酸（HA）包裹的 GlaB（HA-GlaB）的剂量-时间依赖性反应；
  2. Western blot，分析靶蛋白表达水平；
  3. 划痕实验，检测细胞迁移能力；
  4. 集落形成实验，评估癌细胞的集落形成能力；
  5. 流式细胞术，研究细胞死亡。
结果显示，游离 GlaB 和 HA-GlaB 均以剂量-时间依赖的方式显著降低 iCCA 细胞的存活率、迁移能力、集落形成能力和 Gli1 水平，导致癌细胞的侵袭能力显著下降；此外可诱导癌细胞坏死和凋亡。
总而言之，Hh 信号通路参与了包括 iCCA 在内的多种肿瘤的发生发展，GlaB 可通过抑制 Hh 信号通路而抑制肿瘤细胞生长、存活、侵袭并诱导肿瘤细胞死亡，是一种潜在抗癌药物，具有进一步的研究以验证。



超声引导定量荧光分子内镜联合 

durvalumab-680 LT 可实现药物分布可视化



食管癌局部晚期（EC）可接受新辅助放化疗（nCRT）联合手术治疗，但 nCRT 后仅有 16～43% 的患者达到病理完全缓解。加用靶向程序性死亡受体-1 或其配体（PD-1/PD-L1）的免疫检查点抑制剂（ICI）以提高缓解率，但如何确定适用患者尚不明确。
肿瘤内和肿瘤间的异质性导致活检组织中 PD-L1 表达的预测治疗反应能力时高时低，nCRT 对 ICI 反应的影响也尚不清楚。
来自荷兰格罗宁根大学医学中心的 Anne M. van der Waaij 指出，可以利用新的影像学方法以了解PD-L1 异质性，并可用于筛选出适合 ICI 治疗的患者。Anne M. van der Waaij 等研究者进行一项研究，评估了超声引导定量荧光分子内镜（US-qFME）的安全性和可行性。该研究使用荧光标记的 ICI 药物durvalumab-680 LT，在 EC 患者 nCRT 前后进行检测，从宏观到细胞水平将 PD-L1 药物分布情况进行可视化。
图 6 实验示意图
研究者对 durvalumab-680 LT 剂量进行了探索，截至本次报告前已有 18 例计划进行 nCRT 的 EC 患者被纳入对照组（未接受 durvalumab-680 LT），4.5 mg、15 mg 或 25 mg durvalumab-680 LT。此后，将最优剂量组将扩大到 16 例患者，总受试者人数预计为 36 人。
图 7 目前纳入研究的受试者
所有受试者在 nCRT 治疗前后均进行 US-qFME 检查，具体项目包括体内荧光信号可视化，健康食管组织、肿瘤和/或淋巴结黏膜超声引导光谱测量定量，以及组织活检。随后进行体外研究以定量荧光信号，将药物分布和药物靶细胞进行可视化。
在进行内窥镜检查时将荧光进行可视化，可以看到蓝色表示低荧光，红色表示中等，黄色表示高荧光。随着 680 LT 剂量的增加，荧光信号逐渐变强。
图 8 随着药物剂量的增加，食管内荧光信号变强
将荧光进行量化后发现，在一些患者中肿瘤组织中荧光信号明显高于健康组织，而一些患者中荧光信号无明显差别。在 nCRT 治疗后，肿瘤组织的荧光定量均处于较低水平。
图 9 治疗前肿瘤组织和正常组织中的荧光定量结果
在荧光显微镜下，可看到 15 mg 以上 durvalumab- 680 LT 可显示出膜结合的 durvalumab 的分布情况。
图 10 荧光显微镜下可见
总而言之，该研究尚在进行中，初步结果表明，US-gFME 联合 durvalumab-680 LT 可实现药物的可视化和定量，但在患者之间的信号是不均匀的，特别是在 nCRT 之前。此外，荧光显微镜显示的 durvalumab 分布与 PD-L1 表达无关。



一种新的结直肠癌通用 CRISPR RNP 筛选技术



Wnt 信号通路和 P53 信号通路在结直肠癌（CRC）的发生发展中起到关键性作用，深入了解这些通路之间的相互作用有助于开发新的治疗药物。来自德国癌症研究中心的 Carl Philipp Schilling 等研究者，发开出一种高通量阵列表型筛选技术，将多重 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白（RNP）敲除与荧光基团通路报告系统、细胞核免疫组化染色以及荧光成像相结合，以实现在单细胞水平上对敲除和通路激活效应进行表型分析，从而发现 Wnt 和 p53 信号通路之间的新联系。
研究者在结直肠癌细胞系和患者来源的结直肠癌类器官中进行基于 CRISPR/Cas9 RNP 的多重敲除，并通过体外转录产生了单向导 RNA（sgRNA）。Carl Philipp Schilling 指出，与传统的基于质粒或慢病毒的 CRISPR 递送方法相比，利用 RNP 进行基因组编辑和使特定的靶基因突变可以实现更加快速和精确的基因编辑，并且脱靶效应更少。此外，RNP 编辑复合物分子很小，可用于多重敲除多个靶基因，或通过同时靶向多个 sgRNA 来提高单个基因的敲除效率。
图 11 技术原理
利用优化后的 RNP 敲除平台，研究者在 6 个具有不同 Wnt 和 p53 信号通路突变背景的 HCT-116 来源的贴壁细胞系中进行了 180 个 CRC 相关靶基因的阵列表型筛选。在细胞固定和染色后，使用荧光显微镜图像在计算机视觉技术模拟下进行细胞分割，实现在单个细胞中监测 p53 和 Wnt/β-catenin 信号通路的转录活性。
研究发现，与使用单个 sgRNA 相比，在敲除实验中联合 4 个靶向同一基因的 sgRNA 可以显著提高整体效率，而不影响细胞的生长和活力。在每个基因中使用 4 个靶标可提高 CIRPSR/Cas9 RNP 敲除方案的效率，在贴壁结直肠癌细胞系中，使用脂质体复合递送技术的总敲除效率 > 90%，在患者来源的结直肠癌类器官中，使用电穿孔技术的总敲除效率 > 40%。
图 12 联合使用 4 种 sgRNA 可以在 CRC 细胞系中进行近乎完全的混合基因敲除
在阵列表型筛选中，使用基于荧光基团报告系统与转录因子 7 样蛋白 2 (TCF7L2 )的 DNA 转录因子结合位点偶联以测定 Wnt 信号通路的激活与失活，使用荧光免疫组织化学染色以测定 p53。
总而言之，研究者将 CRISPR/Cas9 RNP 技术与详细的影像学和表型分析相结合，开发出一种新的技术以分析 Wnt 和 p53 信号通路在结直肠癌中的作用。这种方法适用于各种胃肠道实体肿瘤中各类基因或信号通路的研究。

 专家点评 

今年十月，在欧洲奥地利维也纳进行的欧洲胃肠病学大会上，来自全球的科学家围绕消化道疾病汇报了最新的研究进展。其中既有前沿的基础研究：Hh 信号通路参与了包括 iCCA 在内的多种肿瘤的发生发展，GlaB 可通过抑制 Hh 信号通路而抑制肿瘤细胞生长、存活、侵袭并诱导肿瘤细胞死亡，是一种潜在抗癌药物；将 CRISPR/Cas9 RNP 技术与详细的影像学和表型分析相结合，开发了一种新的技术以分析 Wnt 和 p53 信号通路在结直肠癌中的作用等。又有丰富的临床应用研究：Menar Ekizce 教授建立了一个基于患者来源类器官（PDO）的治疗反应预测模型，可用于助力肿瘤的精准医疗；Alexander Bartram 等成功验证 CSA 凝集素可准确区分海绵胶囊的取样是否充足，可以降低整体患者召回率，优化实验室处理流程并降低检查成本；US-gFME 联合 durvalumab-680 LT 可实现药物的可视化和定量。众多的基础和临床胃肠病科学家借此交流的机会推动了胃肠病学的发展。

专家介绍

白小武 教授
南方医科大学南方医院结直肠外科教授、博士生导师、博士后合作导师


  • 南方医科大学高层次引进人才

  • 主持和参与多项国家自然科学基金面上项目等
  • 以通讯、第一作者在Nature Reviews Bioengineering等国际著名期刊发表论著

策划：Marceau

投稿：liangchuanlei@dxy.cn
题图来源：站酷海洛


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