沈阳农业大学邵俊花教授等：pH值对柞蚕蛹粉凝胶特性及蛋白质热聚集行为的影响
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2024-09-18 21:48
北京
柞蚕蛹富含优质蛋白质,是一种具有很高开发利用价值的食品原料。沈阳农业大学食品学院的丁雨欣,佘雨洋,王欣颖,邵俊花，沈阳农业大学生物科学技术学院的刘彦群,青岛农业大学食品学院的孙京新采用质构仪、流变仪和激光扫描共聚焦显微镜等分析不同pH值对柞蚕蛹粉凝胶特性及蛋白质分子热聚集行为的影响。结果表明:pH值为7时形成的柞蚕蛹粉凝胶网络较为连续和均匀,凝胶保水性最高(51.67%±0.79%,P<0.05);pH值为9时的柞蚕蛹粉有最低的临界凝胶质量分数(8%)、最高的凝胶硬度(41.67 N±3.37 N,P<0.05)和弹性(2.81 mm±0.07 mm,P<0.05)。柞蚕蛹粉凝胶的储能模量与蛋白质的溶解度呈显著正相关(R=0.92,P<0.05),而与蛋白质的凝固率(R=-0.52)和表面疏水性(R=-0.77)呈显著负相关(P<0.05)。pH 值为9时,蛋白质溶解度最高(62.13%±0.63%,P<0.05),表面疏水性最低(70.06 μg±9.32 μg, P<0.05),形成了更多的小尺寸热聚集物并增强了凝胶基质;而在pH值为5时,蛋白质溶解度最低(28.96%±1.13%,P<0.05),表面疏水性最高(195.66 μg±1.30 μg,P<0.05),促使更多的大尺寸热聚集物形成并无序堆叠而削弱凝胶基质。研究旨在通过调节pH值控制柞蚕蛹粉中蛋白质的热聚集行为,进而获得理想质地和保水性的柞蚕蛹粉凝胶。蚕蛹是亚洲的主要食用昆虫之一[1],柞蚕蛹营养价值高,富含溶菌酶、抗菌肽等生物活性成分,且其蛋白质的氨基酸种类齐全、必需氨基酸比例均衡,符合世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)共同提出的食品中理想氨基酸配比,属于易被人体消化吸收的优质全价蛋白质[2]。我国是柞蚕产业大国,年产柞蚕茧7.5万t,占世界总产量的90% 以上[2]。但由于产地较集中和不易运输等问题,目前,我国柞蚕蛹主要以生鲜食品形式出售,或简易加工成罐头、油炸食品和干制品等,加工技术落后,产品单一,且经济收益较低[3]。国外有一些针对蚕蛹在复合肉制品加工中的研究,Kim等[4]利用预处理的蚕蛹作为新型蛋白质原料生产乳化香肠;Park等[1]向猪肉糜中添加蚕蛹粉制备混合肉饼。但现阶段的研究仍停留在使用整个蚕蛹作为非活性成分(不表达本身的广泛技术功能)添加到由其他蛋白质原料制备的复合肉制品中,对蚕蛹自身的加工性能研究较少。复合肉制品或肉类似物的生产大多会涉及富含蛋白质材料的热诱导凝胶化。热诱导凝胶的形成被认为是变性蛋白质按一定顺序发生聚集的结果,包括从蛋白质分子变性形成初级颗粒,再到形成微结构直至构成凝胶网络[5],这个从微观到宏观的转变过程共同决定了凝胶结构的形成。可这一过程也受到诸多因素影响,其中pH值会通过改变蛋白质体系内的电荷分布进而影响凝胶结构和性能[6]。因此,了解如何通过调节pH值控制蛋白质分子的热聚集行为,对于获得所需质地的凝胶食品至关重要。Zhou等[6]研究了pH值对棉籽蛋白凝胶性能的影响,发现pH值小于7时的凝胶硬度高于pH值大于等于7时;Ruiz等[7]发现,pH值为8、9时有利于藜麦蛋白形成微观结构致密的半固态凝胶,而pH值为10、11时的蛋白质聚集性较差,不能形成自支撑凝胶。因此,本研究拟从宏观和微观角度分别探讨不同环境酸碱度[酸性(pH=3)、等电点(pH=5)、中性(pH=7)、碱性(pH=9)]对柞蚕蛹粉凝胶性能和其蛋白质分子热聚集的影响,以期了解柞蚕蛹粉凝胶化机制以及为其作为功能性成分用于开发重组肉制品或相关肉类似物产品提供理论基础和新思路。
1.1 材料与试剂
柞蚕蛹,辽宁省丹东市凤城农产品批发市场。柞蚕蛹粉营养成分(质量分数):蛋白质71.36%±1.00%、脂肪19.91%±0.27%、碳水化合物1.88%±0.93%、灰分3.65%±0.05%、水分3.20%±0.05%。Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、柠檬酸等,分析纯,美国Sigma-Aldrich公司。1.2 仪器与设备
CR21N型离心机,日本日立制造有限公司;UV2700型分光光度计,日本岛津株式会社;粒度分析仪,英国伍斯特郡马尔文仪器有限公司;DHR-1型动态流变仪,美国TA仪器有限公司;CT3 10K型质构分析仪,美国Brookfield有限公司;FV3000型激光扫描共焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CSLM),日本奥林巴斯公司。1.3 实验方法
柞蚕蛹经筛选后进行真空冷冻干燥处理(制冷温度-55 ℃,真空度3 Pa,时间48 h),去除蚕蛹外皮,破碎后过40目筛成粉,-20 ℃储存备用。将制备好的柞蚕蛹粉加入不同pH值(3、5、7、9)的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L Na2HPO4、0.2 mol/L NaH2PO4、0.2 mol/L K2HPO4、0.2 mol/L柠檬酸)中,制备质量分数30% 的悬浮液,记为pH3、pH5、pH7、pH9组。室温(25 ℃)下摇床(200 r/min)水合1 h后,95 ℃下恒温水浴30 min,冰水冷却后4 ℃下保存过夜,并拍照记录外观形态。参考刁小琴等[8]的方法稍作修改。配备动态流变仪和40 mm平行几何板,取1.3.1.1节中质量分数30% 样品悬浮液2 mL加至平行板间隙,于样品边缘处滴加硅油以防止水分蒸发。加热速率为3 ℃/min,冷却速率为5 ℃/min,振荡频率为0.1 Hz,应力为0.1%,进行20 ～ 95 ℃的加热/冷却温度斜坡实验。参考Liu等[9]的方法计算凝胶速率,见式(1)。凝胶速率![]()
式(1)中,凝胶速率,Pa/℃;G′65和G′50分别代表65、50 ℃下的储能模量。参考Mishyna等[10]的方法稍作修改。按1.3.1.1节方法分别制备不同pH值下不同质量分数(2% ～ 15%)的柞蚕蛹粉凝胶。冷却后的凝胶倒置并保存于4 ℃冰箱中过夜,24 h后记录凝胶样品状态并将形成几乎均匀凝胶时样品的质量分数视为临界凝胶质量分数。将1.3.1.1节制备的柞蚕蛹粉凝胶(质量分数30%)切割成约5 mm×5 mm×1 mm的薄片。取20 μL尼罗蓝荧光染液(0.2 g/100 mL)滴加到凝胶表面,并于避光处反应10 min。样品在CSLM上使用100倍浸油物镜(数值孔径1.4)成像。激发波长为633 nm,发射波长为650～800 nm。参考刁小琴等[8]的方法稍作修改。将1.3.1.1节制备的柞蚕蛹粉凝胶(质量分数30%)切割成直径1 cm、高度1 cm的圆柱体。在TPA模式下使用配备了TA10探针的质构分析仪测定硬度、弹性、胶着性、内聚性、咀嚼性和可恢复性形变。形变量为40%,触发点载荷为0.5 N,测试速度为 1 mm/s。将柞蚕蛹粉凝胶切成小碎块,放入装有双层滤纸的离心管中(3 g/管),以6 000 r/min离心15 min (4 ℃)。该过程可使凝胶中的水分因重力被甩出而吸附在滤纸上,保水性(water holding capacity,WHC)计算方法见式(2)。式(2)中,m(离心后)为离心后柞蚕蛹粉凝胶质量,g;m(离心前)为离心前柞蚕蛹粉凝胶质量,g。参考Mishyna等[10]的方法并稍加修改。为去除脂肪干扰,将柞蚕蛹粉分散于石油醚中(固液比1∶10 g/mL),于20 ℃下磁力搅拌2 h。在6 000 r/min、4 ℃下离心15 min,收集沉淀物。20 ℃的通风橱中挥发过夜以去除溶剂残留物,得到脱脂柞蚕蛹粉。将脱脂粉悬浮于磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L Na2HPO4、0.2 mol/L NaH2PO4、0.2 mol/L K2HPO4、0.2 mol/L柠檬酸)中使质量分数达1%,室温(25 ℃)下将样品置于摇床(200 r/min)水合1 h以提高蛋白质溶解度,用粗纱布过滤残留的固体颗粒,再在10 000 r/min、4 ℃下离心15 min。收集上清液即为蛋白质分散体,其中蛋白质占干基质量的80.31%～84.97%。利用考马斯亮蓝染色法测得上清液中的蛋白质质量浓度,并与样品总蛋白质质量浓度相比计算蛋白质溶解度。参考Mishyna等[10]的方法并稍加修改,将获得的蛋白质分散体分成2组,并分别在室温(25 ℃)和95 ℃恒温水浴锅中保持30 min。 冷却后,将95 ℃热处理的蛋白质分散体于10 000 r/min、4 ℃下离心15 min(此条件可将大于1 μm的颗粒沉淀并作为不溶物处理)并取上清液。采用考马斯亮蓝染色法测量上清液蛋白质质量浓度,加热后的凝固沉淀蛋白质计算方法见式(3)。蛋白质凝固率=![]()
式(3)中,ρ(总可溶性蛋白)为样品中总可溶性蛋白质质量浓度,mg/mL;ρ(上清液蛋白)为上清液中可溶性蛋白质质量浓度,mg/mL。参考王耀松等[11]的方法并稍加修改。取1.3.2.2节中95 ℃处理后离心的蛋白质分散体上清液,并稀释至利于检测的水平(蛋白质质量浓度约1 mg/mL),涡旋混匀后,在600 nm处直接测定其吸光度,其值表示为蛋白质浊度。为防止大聚集物的干扰,将蛋白质分散体稀释至质量分数0.1%,分成2组分别在25 ℃和95 ℃处理30 min。处理后样品在室温(25 ℃)下的毛细管池中平衡1 min后,使用粒度分析仪进行ζ-电位测量。粒径分析使用的蛋白质样品和设备与ζ-电位测量时相同,于室温下进行,参数设定为633 nm激光、173°固定散射角、1.45折射率和80 s的平衡时间。平均流体力学直径单位为nm。参考卢亚东等[12]的方法并稍加修改。将蛋白质分散体调整蛋白质质量浓度至5 mg/mL,分成2组于25 ℃和95 ℃处理30 min。各取加热前后样品1 mL与200 μL溴酚蓝溶液(1 mg/mL)混匀。混合液在6 000 r/min下离心15 min,取上清液并稀释10倍,于595 nm处测量吸光度。对照组不含样品蛋白质。以溴酚蓝固定量表征蛋白质溶液表面疏水性(μg)计算方法见式(4)。溴酚蓝固定量![]()
式(4)中,A1为对照组吸光度;A2为样品吸光度;200为样品中加入的溴酚蓝质量,μg。参考夏轩泽等[13]的方法并稍加修改。取1 mL蛋白质分散体(蛋白质质量浓度约5 mg/mL)分别于25 ℃和95 ℃下反应30 min。为测定活性硫基含量,向其中加入6 mL三甘氨酸缓冲液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L 甘氨酸、4 mmol/L EDTA,pH 值为8),总巯基的测量需另添加8 mol/L 尿素。向混合液中添加0.04 mL 的Ellmann试剂(5,5′-二硫代-双-硝基苯甲酸溶液,4 g/L),涡旋混匀后在室温下培养45 min,于6 000 r/min下离心15 min(4 ℃),取上清液并于412 nm处测吸光度。巯基质量摩尔浓度计算见式(5)。b(巯基)![]()
式(5)中,b(巯基)为巯基质量摩尔浓度,μmol/g;13 600为摩尔吸光系数,L/(mol·cm);A412为样品在412 nm下的吸光度;D为比色光径,cm;ρ为样品溶液蛋白质质量浓度,mg/mL。1.4 数据处理
所有分析均进行3次重复实验,结果以平均值±标准偏差表示。利用SPSS软件进行方差分析,用Duncan’s方法进行多重检验,以95%置信区间表示样本间的统计显著性差异(P<0.05)。
2.1 不同pH值对柞蚕蛹粉凝胶特性的影响
图1展示了柞蚕蛹粉体系在不同pH值下的热凝固温度梯度曲线,表1为柞蚕蛹粉体系在不同pH值下的流变性能参数。温度在20～40 ℃,储能模量G′和损耗模量G″均恒定或略微下降,这可能是因为该温度不足以充分扩展蛋白质结构,反应性基团无法大量暴露,蛋白质分子间没有密切交联[6]。当温度超过40 ℃后,蛋白质聚集体逐渐形成,凝胶基质开始增强,G′和G″迅速上升。损耗角δ可以反映蛋白质在加热过程中的动态变化[图1(c)]。在加热前期,所有处理组的tanδ均大于1,而加热后期的tanδ均小于1,说明在加热后期体系凝胶化逐渐完成并形成有典型弹性特征的凝胶,即G′ >G″。通常将首次G′ >G″时对应的温度设定为凝胶相变初始温度Tgel[14](见表1)。pH 5组的Tgel显著高于其他处理组(P<0.05),这可能是由于等电点时蛋白质内斥力弱,蛋白质构象紧密,热稳定性较高,需更高温度促使凝胶化;而远离等电点时的Tgel较低,这可能是因为体系中较高的净电荷量带来了更强的分子内作用力,从而降低了蛋白质热稳定性,使凝胶化温度下降[15]。另外,凝胶速率也影响凝胶性能,仅pH 3组的凝胶速率显著高于其他3组(P<0.05),这可能是其体系黏弹性差的原因之一。因为当蛋白质变性和聚集速率间的动态平衡被破坏后,过快的凝胶速率可能不利于蛋白质定向,导致无序凝结物的形成[16]。低 pH 值可能使蛋白质在加热前提前变性,蛋白质结构展开,疏水基团暴露,导致蛋白质提前聚集,从而只能在加热后形成弱凝胶基质[17]。由表1可知,凝胶体系冷却循环后的最终G′和G″均随pH值升高而逐渐增大,这可能是因为低pH值下,蛋白质悬浮液不稳定而产生大小分布不均匀的聚集体颗粒,不利于良好凝胶的形成[7];而高pH值下的较高G′代表凝胶体系中的蛋白质相互作用力更强,凝胶基质更牢固。此外,在冷却阶段,柞蚕蛹粉凝胶体系的黏弹性指数继续大幅度提高,这可能是由于温度降低导致体系流动性下降、蛋白质聚集体迁移率降低,从而增加了氢键作用而强化凝胶[18]。G′1和G″1、G′2和G″2分别表示加热和冷却过程中的储能模量和损耗模量。不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。图1 升温和降温过程中柞蚕蛹粉在不同pH值时的热凝固温度梯度曲线2.1.2 对柞蚕蛹粉临界凝胶质量分数和凝胶外观的影响不同pH值对柞蚕蛹粉临界凝胶质量分数和凝胶外观的影响见图2。临界凝胶质量分数定义为凝胶在管中不下滑时对应的柞蚕蛹粉最低质量分数,其值越低代表体系形成凝胶的能力越强。由图2(a)可知,在酸性(pH=3)和等电点(pH= 5)条件下,柞蚕蛹粉的临界凝胶质量分数分别为13% 和12%;相比之下,中性(pH=7)和碱性(pH=9)条件更有利于提高柞蚕蛹粉的凝胶化能力,临界凝胶质量分数分别下降至9% 和8%。这表明冻干柞蚕蛹粉具有可媲美一些传统蛋白凝胶剂的凝胶化能力,如乳清浓缩蛋白(6%)、米粉(6%)和小麦粉(8%)[19]。也有一些昆虫曾被报道有较强的凝胶化能力,Omotoso[20]曾发现,一种家蚕蛹粉末的临界凝胶质量分数接近6%。此外,热处理过程中使用的温度和时间的差异也可能影响该值。图2 不同pH值对柞蚕蛹粉临界凝胶质量分数和凝胶外观的影响柞蚕蛹粉有良好的热凝固行为,表现为聚集和形成稳定网络的能力,在适当条件下可形成有较好承受切割、挤压能力的固体凝胶。由图2(b)可知,酸性条件(pH=3)可能导致柞蚕蛹蛋白质在加热前即部分被酸变性和/或水解,体系黏度下降而蛋白质凝固性降低[21],凝胶基质易软化坍塌,质地更接近豆腐状,这与流变分析中的结果一致,即低 pH值环境可能使蛋白质在加热前大量暴露疏水基团而提前聚集,只能在加热后形成弱凝胶。随着pH值的升高,凝胶基质明显加强,且在pH值为9时,凝胶表面出现了清晰的小孔结构,有研究发现,随着大豆蛋白凝胶基质的增强和硬度的提高,凝胶也逐渐由细密无孔转变为气孔较多较大的状态,可能因热处理使内部水分部分丧失,凝胶体积收缩[22]。微观结构是探究凝胶内部结构的重要手段。不同pH值下,柞蚕蛹粉凝胶的微观结构见图3。其中,蓝色区域代表蛋白质网络,黑暗区域代表非蛋白质相。酸性(pH=3)凝胶[图3(a)]可能由于蛋白质被提前变性和/或水解而只能形成松散分布的热聚集体颗粒,交联程度差,有更多大面积断裂[21],这与2.1.2节对凝胶外观的描述结果一致。等电点(pH=5)凝胶[图3(b)]由于静电斥力弱,蛋白质可能发生了大幅度聚集而无序堆叠,影响蛋白质间的密切交联,凝胶网络结构较无序和疏松[14]。中性(pH=7)和碱性(pH=9)凝胶[图3(c)、(d)]网络中的蛋白聚集体颗粒明显更分散化且排布相对更规律,这可能是因为远离等电点后,蛋白质分子链更易伸展而相互交联,易形成较精细的微观结构[14]。类似结果也出现在其他报道中,韩宗元等[23]对热诱导蛋白凝胶结构受pH值的影响进行了研究,发现在pH>pI时,通常易形成有序均匀状凝胶结构,而pH≤pI时,更易形成粗糙无序状凝胶结构。质构是表征凝胶品质的重要指标之一,不同pH值下柞蚕蛹粉凝胶的质构变化见表2。硬度影响产品口感,咀嚼性可说明产品的多汁性,弹性和内聚性则与产品的可塑性直接相关。由表2可知,在pH值为3时,柞蚕蛹粉凝胶的质构性能最差,其可恢复性形变、内聚性、弹性、咀嚼性、硬度和胶着性均最低(P<0.05)。当pH值升高到7时,凝胶可恢复性形变和内聚性最高。当pH值继续升高到9时,凝胶硬度最大,为41.67 N±3.37 N(P<0.05);而此时柞蚕蛹粉凝胶的弹性、咀嚼性和胶着性也显著更高(P<0.05)。这一现象很好地解释了动态流变学特性中G′和G″均随pH值的升高而增大的规律。对于柞蚕蛹粉凝胶来说,中性和偏碱性条件更易形成高强度凝胶,而酸性凝胶则对断裂更敏感,这与其微观结构的均匀性和致密性结果一致。不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。优良的保水性对于凝胶型食品体系是必不可少的[24],不同pH值对柞蚕蛹粉凝胶保水性的影响见图4。在pH值为3时,柞蚕蛹粉凝胶的保水性最低(P<0.05),为49.18%±0.96%。这可能是因为酸性凝胶基质较弱,且包含更多的孔隙水通道,使凝胶截留水的能力被弱化[25],在微观结构的观察中发现了类似结果。随着pH值的升高,凝胶的保水性呈上升趋势,至pH值为7时,达到最大值51.67%±0.79%(P<0.05)。微观结构的分析也证明了中性凝胶的网络孔隙较小,网络结构有较大的比表面积,使得蛋白质与水分子的接触面积增加,从而提高了凝胶基质截留水的能力[25]。但pH 5、pH 7和pH 9这3组的凝胶保水性并无显著性差异,可能是因为这3组凝胶都呈现孔状网络结构,均造成了一定程度的水分损失。倪娜等[26]也发现了类似结果,即羊血浆蛋白凝胶的保水性在pH值为6.2、7.4、8.6、9.8时均无显著性差异。相关性分析表明,柞蚕蛹粉凝胶的保水性与凝胶的质构特性,尤其是硬度(R=0.73)和咀嚼性(R=0.76),呈显著正相关(P<0.05),即提高pH值在改善凝胶质地性能的同时也增强了持水能力。2.2 不同pH值对柞蚕蛹粉蛋白质特性的影响
2.2.1 对柞蚕蛹粉蛋白质溶解度和热凝固性的影响不同pH值对柞蚕蛹粉蛋白质溶解度、凝固率和浊度的影响见表3。蛋白质溶解度是决定其功能特性的关键。由表3可知,柞蚕蛹蛋白pI为4.5～5.0,等电点(pH=5)附近的蛋白质溶解度最低,因为此时蛋白质分子间的排斥力最弱,更易相互靠近和聚集从而形成沉淀。周心雅等[27]曾发现,在pH值逼近等电点时,蛋白质溶解度的降低会导致蛋白质分子无序聚集,形成更易渗水和弱化的凝胶。而碱性(pH=9)条件更利于柞蚕蛹蛋白的大幅度溶解,蛋白质这种在水中溶解能力增强的性质可能帮助其在热诱导过程中更好地分散和交联,提高凝胶强度[28],这也验证了本研究凝胶质构的分析结果。表3 不同pH值对柞蚕蛹粉蛋白质的溶解度、凝固率和浊度的影响不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。由表3可知,在95 ℃加热30 min后,蛋白质大量热凝固,可能是天然蛋白质空间结构被高温破坏,促进了活化能的降低,增加了蛋白质间相互作用并形成聚集体的可能性[29]。其中,pH 5组的蛋白质热凝固率更高(P<0.05),可能是排斥力减弱导致的,这与溶解度结果一致。在pH值为3、 9时,蛋白质分子间的高静电斥力使其更易分散在溶剂中,从而降低凝固程度[30]。这与Mishyna 等[10]对蜜蜂可溶性蛋白热凝固行为的研究结果相近,即在更极端pH值下,需更高的蛋白质凝结度以形成凝胶。相关性分析表明,蛋白质溶解度与柞蚕蛹粉凝胶的G′(R=0.92)和G″(R=0.81)均呈显著正相关(P<0.05);而蛋白质凝固率与凝胶的G′(R=-0.52)和G″(R=-0.19)均呈显著负相关(P<0.05),即提高pH值可通过增加溶解蛋白的数量,减少不溶性蛋白质凝固物的数量促使强交联凝胶基质的形成。凝固蛋白的结果表达了收集的沉淀,即大颗粒不溶性聚集体的形成情况;而上清液浊度的变化可用于监测可溶性小颗粒聚集物的形成过程,因为蛋白质聚集后颗粒直径会增大,导致浊度上升[31]。由表3可知,pH值为5更利于大的不溶性聚集物的形成,减少了可溶性聚集物的数量,这可能是其微观结构粗糙的原因之一。因为有研究表明,较大颗粒的蛋白质絮凝或沉淀易成为不溶物参与到凝胶网络形成中,从而削弱凝胶形成趋势或降低凝胶性能[7]。而在pH值为9时,蛋白质更易溶解和分散,形成的可溶性聚集物含量较高,这些可溶性聚集物更易作为活性填充物和结构单元参与凝胶网络的形成,使凝胶网络机械性能增强,表观黏弹性增加[32],这与流变特性的结果一致。Nicorescu 等[33]在研究乳清蛋白热聚集中也发现,相比于在蛋白质等电点处形成的更多大尺寸聚集物,较小尺寸可溶性聚集体的增加可能更有利于均匀凝胶的形成。不同pH值对加热前后柞蚕蛹粉蛋白质ζ-电位的影响见图5。蛋白质的聚集或分散是表面电荷相互作用的结果[17]。由图5可知,pH值为5时蛋白质的净电荷量极低,分子间引力最大;因此,聚集程度最大。而pH值为3、9时,体系内的净电荷量升高,分子间排斥力增强,抑制了蛋白质聚集,这印证了蛋白质凝固率的结论。Donovan等[15]对β-乳清蛋白的研究发现,高净电荷量可能会带来更强的分子内作用力,促进蛋白质变性;而等电点附近的净电荷量低,蛋白质分子内斥力弱,蛋白质结构稳定性更高。这解释了流变特性分析中,pH 5处理组的Tgel较高的原因。另外,加热后的所有处理组净负电荷量均减少,净正电荷量有所上升,可能因高温下蛋白质结构的破坏导致内部带正电基团的暴露,改变了电荷分布[34]。总之,pH值可通过影响柞蚕蛹蛋白氨基酸侧链电荷分布,改变蛋白质分子间的相互作用,从而影响蛋白质的热聚集程度[17]。图5 不同pH值对加热前后柞蚕蛹粉蛋白质ζ-电位的影响不同pH值对加热前后柞蚕蛹粉蛋白质平均粒径的影响见图6。未加热时的蛋白质颗粒尺寸在153.67 nm±13.95 nm到210.06 nm±25.58 nm,变化较小,等电点处蛋白质易聚集使得颗粒尺寸轻微上升(P>0.05)。但热处理后,蛋白质团聚物以pH值依赖的方式大量形成,在pH值为5、 7时形成更多的大颗粒团聚物(平均粒径分别达7 173.78 nm±613.16 nm和3 313.05 nm±584.22 nm)(P<0.05),这与蛋白质凝固率的结果一致。pH值为3、9时形成更多较小尺寸凝固物,这可能是较高的蛋白质溶解度导致的,这与浊度的结果一致。图6 不同pH值对加热前后柞蚕蛹粉蛋白质平均粒径的影响蛋白质聚集体的粒径大小与凝胶结构和性能密切相关。通常来说,蛋白质大颗粒凝固物是凝胶网络构建的前体,这些大颗粒物先聚集组成凝胶框架,随后小颗粒蛋白凝固物或可溶性蛋白会进一步结合到框架上,以填充凝胶网络[5]。因此,推断中性(pH=7)和碱性(pH=9)条件既能构建完整的网络框架,又可提供更多的可溶性蛋白质和/或小颗粒蛋白凝固物以增强网络密集性,从而提高凝胶的质构和保水性能;而等电点(pH=5)处虽可形成足够多的大颗粒聚集物,但无法密集填充网络,凝胶性能下降;酸性(pH=3)条件下虽可形成较多可溶性聚集体,但蛋白质过度被酸变性而破坏了蛋白质受热展开与聚集间的动态平衡,未形成完整有序的凝胶网络[17]。相关性分析表明,柞蚕蛹蛋白质的热聚集物尺寸与蛋白质凝固率(R=0.87)呈显著正相关(P<0.05),而与蛋白质浊度(R=-0.98)和凝胶体系G′(R=-0.38)呈显著负相关(P<0.05),即提高pH值可通过降低蛋白质颗粒尺寸而减少不溶性凝固物的干扰,增加可溶性小凝固物的数量而增强凝胶基质弹性。蛋白质的表面疏水性是反映蛋白质变性程度和凝胶性能的重要特征[12],不同pH值对加热前后柞蚕蛹粉蛋白质表面疏水性的影响见表4。在未加热时,pH值的变化改变了蛋白质分子的水化作用和溶解性,因此不同处理组的表面疏水性之间有显著差异,其中pH值为3时的表面疏水性明显更高(P<0.05),这可能是因为蛋白质在加热前就被酸诱导变性和/或水解而暴露了更多的疏水性区域。而pH值为9时的表面疏水性较低,一般情况下,蛋白质的表面疏水性与其溶解度呈负相关[35]。加热后所有处理组的表面疏水性均有所上升,这可能是因为温度破坏了稳定蛋白质二级和三级结构的键,导致内部掩藏的疏水性基团暴露[10]。且pH 5组的表面疏水性显著高于pH 3、pH 7和pH 9组(P<0.05),这可能是因其蛋白质内部疏水性区域的开放程度更大[10],使得其能与溴酚蓝相互作用的疏水性氨基酸残基增多,这代表更多的蛋白质间相互作用从亲水性向疏水性转变,从而使热凝固程度增加。疏水相互作用可能是促进柞蚕蛹蛋白质热聚集的关键作用力之一。表4 不同pH值对加热前后柞蚕蛹粉蛋白质表面疏水性的影响不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)。热处理前后柞蚕蛹粉蛋白质巯基含量的变化见图7。加热前,pH 9组的埋藏巯基含量最低,活性巯基含量最高(P<0.05),这可能是因为体系中的高净电荷带来的强烈分子内力促进了蛋白质空间结构的伸展,使内部巯基暴露[10]。另外,天然柞蚕蛹蛋白质中二硫键的解离也可能增加活性巯基的含量。加热后,所有处理组的总巯基含量均有不同程度的下降,这可能是因为游离在蛋白质表面的活性巯基转化为更多的二硫键,并有助于蛋白质分子间交联、聚集[10]。其中,pH值为5、7时的活性巯基含量在加热前后分别减少了62.88% 和61.04%,而pH值为3、9时仅分别减少了8.28%和24.18% (P<0.05),这说明pH值为5和7的条件可能有利于更多二硫键的形成。考虑到pH值为5和7时蛋白质热凝固率较高,因此共价相互作用也可能是促进柞蚕蛹蛋白质热聚集的另一关键作用力。不同小写字母表示组间埋藏巯基含量差异显著(P<0.05),不同大写字母表示组间活性巯基含量差异显著(P<0.05)。图7 不同pH值对加热前后柞蚕蛹粉蛋白质巯基含量的影响相关性分析表明,蛋白质活性巯基的减少量与柞蚕蛹粉凝胶的硬度(R=0.55)和保水性(R=0.61)均呈显著正相关(P<0.05),即巯基向二硫键的转化可能对提升凝胶性能起关键作用。
本研究发现,pH值会影响柞蚕蛹粉蛋白质的带电状态,从而影响蛋白质的变性、聚集,最终造成凝胶表观属性的不同。酸性(pH=3)条件下,蛋白质提前被酸水解和变性而无法形成完整的凝胶网络,进而导致柞蚕蛹粉凝胶基质的弱化和凝胶性能的下降;等电点(pH=5)附近,蛋白质的溶解度降低,且最低的静电相互作用、最高的巯基向二硫键转化量以及疏水相互作用共同促使了蛋白质大量热聚集而堆叠成粗糙交联的凝胶网络,柞蚕蛹粉凝胶硬度和保水性较弱;中性(pH=7)和碱性(pH=9)条件下,蛋白质的溶解度升高,体系内的疏水相互作用减弱,形成了由更多可溶性蛋白或分散均匀的小颗粒聚集物构成的致密凝胶网络,柞蚕蛹粉凝胶硬度和保水性较强。另外,当pH值从3升高至9时,柞蚕蛹粉的临界凝胶质量分数从13% 降低至8%,说明碱性条件更有利于提高柞蚕蛹粉的凝胶形成能力。而肉类食品的生产环境大多为中性或偏碱性,可见柞蚕蛹良好的凝胶性使其适用于开发肉类产品。研究结果旨在为将柞蚕蛹作为功能性成分生产肉类似物或部分替代重组肉制品(如火腿、肉丸、鱼糜制品等)中的蛋白质原料提供理论基础。但考虑柞蚕蛹粉混合体系中的复杂成分,还需对柞蚕蛹蛋白与多糖、脂肪等低含量成分的相互作用进行更详细的研究,同时进一步考虑如何模仿与肉类相似的感官属性。引用格式：丁雨欣,佘雨洋,王欣颖,等.pH值对柞蚕蛹粉凝胶特性及蛋白质热聚集行为的影响[J]. 食品科学技术学报,2023,41(4):54-66.
DING Yuxin, SHE Yuyang, WANG Xinying, et al. Effects of pH on gel properties and protein thermal aggregation behavior of Antheraea pernyi pupae flour[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(4):54-66.
基金项目：国家自然科学基金面上项目(31871826);辽宁省科学技术计划项目(2021-NLTS-11-02);沈阳市中青年科技创新人才支持计划项目(RC210420)。
Foundation: National Natural Science Foundation of China(31871826); Liaoning Provincial Science and Technology Plan Project (2021-NLTS-11-02); Shenyang Young and Middle-Aged Scientific and Technological Innovation Talent Support Program (RC210420).
