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本期分享的研究成果于2024年9月26日发表于European Journal of Medicinal Chemistry，由四川大学原子核科学技术研究所的刘宁教授和李飞泽教授团队完成，第一作者为叶天真博士。研究重点是开发出一种基于砹-211标记的APBA-FAPI分子，用于恶性胶质瘤的靶向α治疗。相比其它核素，砹-211的半衰期（约7.2 h）足以确保它在进入体内后有足够时间发挥治疗作用，而不会产生过长的辐射暴露，因而减少了对正常组织的损害。此外，砹-211的α粒子具有穿透距离短、能量高的特点，能够精准杀伤癌细胞，而不会影响周围健康组织。这一特点使得砹-211特别适用于高选择性和高效的靶向治疗，在恶性胶质瘤等难治性癌症的治疗中展现了巨大潜力。
研究背景
作为癌症相关成纤维细胞的独特生物标志物之一，FAPα在90%以上的上皮癌中高表达，而在健康组织中则低或几乎没有表达，但小分子成纤维细胞活化蛋白抑制剂（FAPI）的出现重新赋予该靶点在癌症诊断中的潜力。因此，标记有18F、68Ga和99mTc的多种FAPI已显示出在肿瘤病灶中显著的累积效果，并且具有良好的肿瘤与背景比率，展示出极大的功能性癌症成像潜力。
在放射性标记FAPI的治疗应用方面，90Y-FAPI-04、90Y-FAPI-46及177Lu-DOTA-SA-FAPI被先后开发。大阪大学的Tadashi Watabe教授团队开发的225Ac-FAPI-04也在小鼠异种移植模型中显示出良好的肿瘤抑制效果，且无显著毒性。然而，先前研究表明FAPI-04在4小时内从癌细胞中快速流出，远短于90Y（T1/2 = 64.05 h）、177Lu（T1/2 = 6.64 d）和225Ac（T1/2 = 9.92 d）的半衰期。因此，相关制剂的肿瘤杀伤效果有限。毫无疑问，使FAPI的肿瘤滞留时间与治疗性放射性核素的物理半衰期相匹配具有重要意义。
与上述放射性核素较长的物理半衰期相比，211At的7.2h半衰期与FAPI-04的生物半衰期更加匹配。此外，211At的短程 α 粒子具有出色的肿瘤杀伤能力，对正常组织影响极小，在能够确保放射性砹化合物达到理想的治疗效果的同时，拥有更高的安全性。
方案 1. 几种常用于 FAPI 的放射性砹标记的双功能偶联剂及本工作中使用的双功能偶联剂。
研究结果
作者首先合成FAPI锡前体化合物，通过一步法取代反应，成功合成了211At-APBA-FAPI，放射化学产率达到令人满意的水平（>60%）。211At-APBA-FAPI在体外表现出优异的稳定性、显著的肿瘤亲和力，以及对FAPα阳性U87MG细胞的特异性杀伤效果。分子对接分析表明，结合了白蛋白结合剂的FAPI可通过多重分子间相互作用与FAPα蛋白结合，结合能达到−9.66 kcal/mol。在小鼠异种移植模型中，211At-APBA-FAPI表现出良好的靶向性，其肿瘤滞留时间显著长于此前报道的放射性标记化合物。因此，211At-APBA-FAPI显示出显著的治疗效果，且对正常器官和组织的毒性在可接受范围。这些结果表明，引入多功能结合剂可以有效增强FAPI与211At偶联的可用性及其肿瘤杀伤效果，为基于放射性标记FAPI衍生物的靶向α治疗的临床转化提供了重要启示。
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化学合成与131I/211At标记
方案2. 131I-IPBA-FAPI/211At-APBA-FAPI的合成路线
图 1. 131I-IPBA-FAPI/211At-APBA-FAPI 的TLC色谱图，色谱条件：DCM/MeOH，10/1，v/v（A）。natI-IPBA-FAPI 和 131I-IPBA-FAPI 的放射性HPLC图，流动相：40% 乙腈水溶液中，含 0.1% 三氟乙酸（B）。
131I-IPBA-FAPI和211At-APBA-FAPI的合成和放射性标记策略如方案2所示（由于211At半衰期相对较短，选择131I作为类似物以优化211At-APBA-FAPI的合成条件）。最终，211At-APBA-FAPI未校正衰变的放射化学产率（RCY）≥60%。经纯化后，211At-APBA-FAPI的放射化学纯度（RCP）≥95%，放射性浓度为35 MBq/mL。
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体外稳定性与亲脂性研究
211At-APBA-FAPI在模拟生理介质中表现出足够的稳定性（图2A）,其在PBS中的放射化学纯度（RCP）在24小时时仍保持在88.17 ± 2.36%，在胎牛血清中的RCP则高达91.4 ± 0.60%，表明其具有良好的稳定性。如图2B所示，211At-APBA-FAPI的脂水分配系数（Log P）为2.37 ± 0.04，高于211At-FAPI-04的1.96 ± 0.01，表明211At-APBA-FAPI的亲脂性更高，这主要归因于APBA的引入。
图2. 通过在37°C下分别于PBS和胎牛血清中孵育3、6、12和24小时，测试211At-APBA-FAPI的体外稳定性（A）。131I/211At-FAPI-04和131I-IPBA-FAPI/211At-APBA-FAPI的正辛醇-水分配系数（B）。211At-APBA-FAPI的白蛋白结合能力测定（C）。I(A)PBA-FAPI在体外BBB模型中的转运率（D）。
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白蛋白结合能力与体外BBB模型实验
211At-APBA-FAPI在30min时与人血清白蛋白（HSA）的结合率为7.63 ± 0.22%（图2C）。体外血脑屏障（BBB）模型实验结果显示，131I-IPBA-FAPI的BBB转运率在4小时内逐渐从0.54 ± 0.12%增加至3.71 ± 0.31%，而所制备的211At放射性示踪剂的转运率为2.06 ± 0.38%（图2D）。
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细胞摄取、细胞毒性和蛋白质印迹分析
图3. 经蛋白质印迹（western blotting）分析U87MG细胞中FAPα的表达（A）。U87MG细胞蛋白质印迹结果的灰度分析（B）。不同癌细胞对211At和211At-APBA-FAPI的摄取情况（C）。不同剂量的211At和211At-APBA-FAPI对U87MG细胞活力的影响（D）。
图3A和B显示，所选的U87MG细胞系为FAPα阳性，具有显著的受体表达。211At-APBA-FAPI在U87MG细胞中的摄取从30 min至120 min逐渐增加到40.80 ± 1.03%，显著高于游离211At的摄取率（120min时为2.75 ± 0.21%）（图3C）。此外，211At-APBA-FAPI对U87MG细胞显示出显著的剂量依赖性杀伤效果：随着放射性剂量从18.5增加至148 kBq，癌细胞的活力从70.95 ± 8.01%降低至48.58 ± 4.76%（图3D），游离211At则对U87MG细胞的生长没有显著抑制作用。
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分子模拟计算
图4. FAPI-04（黄色）与活性中心周围氨基酸残基（蓝色）的相互作用：氢键以紫色虚线表示（A）。IPBA-FAPI（黄色）与活性中心周围氨基酸残基（蓝色）的相互作用：氢键以紫色虚线表示（B）。FAPα蛋白与配体在50 ns内结合结构的变化轨迹（C）。IPBA-FAPI与FAPα复合物的RMSD（D）。IPBA-FAPI与FAPα复合物间氢键数量（E）。
FAPα蛋白（PDB ID: 1Z68）被视为典型受体，常用于FAPI与靶点的亲和力模拟研究。对比分析中，FAPI-04与FAPα蛋白的分子对接得分为−10.44 kcal/mol，而IPBA-FAPI的对接得分为−9.66 kcal/mol，表明引入IPBA对整体结构的肿瘤靶向性没有影响。具体而言，FAPI-04倾向于在活性位点附近与GLU-203、GLU-204、MET-205和VAL-352形成氢键（图4A）。而IPBA-FAPI可以与ASN-399、ILE-398和ILE-400产生多重氢键作用（图4B）。进一步的分子动力学模拟也显示，IPBA-FAPI可以稳定地与FAPα蛋白结合（图4C）。在25 ns内，均方根偏差（RMSD）达到平衡，稳定在约0.30 nm（图4D）。在50 ns的模拟过程中，IPBA-FAPI和FAPα复合物之间的氢键数量相对稳定，保持在2-3个左右（图4E）。
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小动物体内试验
图5. 注射211At-APBA-FAPI后1、3、6、12和24小时肿瘤小鼠体内的生物分布（A）。注射211At-APBA-FAPI后1、3、6、12和24小时肿瘤与器官的放射性比值（B）。接受211At-APBA-FAPI的小鼠肿瘤组织中的放射性变化（C）。肿瘤体积变化（D）、体重变化（E），以及用PBS和不同剂量的211At-APBA-FAPI处理的小鼠的生存曲线（F）。
在小鼠脑胶质瘤异种移植模型中进行的生物分布研究确认了211At-APBA-FAPI的肿瘤靶向能力（图5A）。在所有研究时间点，脾脏和肺部的放射性累积均显著，这意味着211At-APBA-FAPI可能通过脾脏和肺部代谢。胃部的放射性摄取可以归因于体内211At-APBA-FAPI的部分去卤化或由胃粘膜分泌主导的非靶向结合。骨骼中的放射性累积可能是由于成骨细胞中可忽略的FAPα表达引起的生理摄取。与预期一致的是，肿瘤部位的放射性摄取水平在前6小时内逐渐增加，与大多数基于FAPI的放射性标记药物的快速洗脱形成对比。如图5B和C所示，211At-APBA-FAPI具有良好的肿瘤-器官比，6小时后肿瘤摄取最高达到6.36±3.73% ID/g。
如图5D所示，在所有放射性核素治疗组中，肿瘤生长显著抑制。0.37、0.74和1.11 MBq治疗组在注射后8天的肿瘤生长抑制率分别为84.98%、92.28%和94.99%。除高剂量组1.11 MBq组外，所有其他组的小鼠在观察期间没有显著体重减轻（图5E）。与PBS组相比，放射性核素治疗组的中位生存期显著延长（图5F）。
图 6. 注射后 7 天对 PBS 和 211At-APBA-FAPI 处理小鼠的血液分析：白细胞计数 (A)、红细胞计数 (B)、血红蛋白 (C)、血小板(D)；肿瘤增殖（Ki67）和凋亡（TUNEL）的免疫组化分析选取了 PBS 组 (E) 和 1.11 MBq 211At-APBA-FAPI 组 (F) 进行。棕色表示 Ki67 阳性，红色表示 TUNEL 阳性。
注射后7天的血液分析表明，低剂量211At-APBA-FAPI治疗对相对于PBS组的关键指标没有明显影响。高剂量组的白细胞计数明显上调，这与电离辐射诱导的炎症反应有关。所有组的红细胞和血红蛋白指标均在安全范围内（图6B和C），而中剂量组的血小板计数略有下降，表明可能存在一定程度的血液毒性风险（图6D）。
免疫组化分析表明，211At-APBA-FAPI在肿瘤组织中具有显著的生物学效应（图6E和F）。PBS组和211At-APBA-FAPI组在注射后7天的Ki67差异表明，211At放射性核素治疗显著抑制了肿瘤细胞的增殖活性。PBS组和211At-APBA-FAPI组的TUNEL分析也验证了这一结果，在211At-APBA-FAPI组中检测到更多肿瘤细胞凋亡。
讨论与结论
FAPα作为肿瘤靶点的优势及现有问题：FAPα在超过90%的恶性上皮肿瘤中高度上调，是理想的肿瘤靶点，为靶向α放射治疗（TAT）药物开发提供了潜力。已有Y-90、Lu-177和Ac-225标记的FAPI在动物模型中显示出积极效果，但存在肿瘤滞留时间与放射性核素半衰期不匹配的问题。
研究结论：该研究将IPBA衍生物引入FAPI配体，使211At标记化合物的药代动力学特性更适合肿瘤治疗，211At-APBA-FAPI在治疗胶质瘤小鼠中展现出良好的肿瘤抑制效果和可接受的毒性，验证了该策略的有效性。改良后的211At-APBA-FAPI展示出良好的化学纯度、放射化学稳定性和血清相对较短的循环时间，且具有一定的白蛋白结合能力，提高了在肿瘤中的滞留效果。
研究不足之处与改进方向：尽管优化了FAPI在肿瘤中的滞留时间，但仍在非肿瘤组织中发现放射性累积现象。此外，血脑屏障的穿透能力还需进一步验证，未来优化方向是调整APBA和FAPI之间的连接子设计，以增强肿瘤靶向性和滞留时间。
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编 辑 ：代 薇
责 编 ：余 飞
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