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文丨Kevin
编丨Kevin
在青霉素发酵过程中，通常通过筛选优良菌株种类，调节菌体的代谢发育和生长等生物过程，给予最适PH、温度、以及发酵液中的碳源和氮源，使生物产量达到最大值。
这些控制条件以及各种生物、理化和工程环境因素对这些过程的影响很大，因此研究菌体的培养规律，外界控制因素和达到最佳效果等问题就成为发酵工程的重要任务。
一、概述
发酵工艺过程不同于化学反应过程。它既涉及生物细胞的生长、生理和繁殖的生命过程，又涉及微生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应及其影响因素的多酶反应过程，所以发酵是微生物、化学和工程等学科的理论和技术的综合利用，由于发酵过程的复杂性，控制其过程是比较复杂的。尤其是控制青霉素等次级代谢产物的发酵。
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二、青霉素的用途及主要生产流程
青霉素是抗菌素的一种，是从青霉菌培养液中提制的药物，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素作为杀菌药，主要作用于大多数革兰阳性菌、革兰阴性球菌、螺旋体和放线菌。青霉素阻抑粘肽合成，造成细胞壁缺损。由于敏感菌菌体内渗透压高，使水分不断内渗，以致菌体膨胀，促使细菌裂解、死亡。
青霉素的杀菌作用特点为：①对革兰阳性菌作用强，对革兰阴性菌作用弱；②对繁殖期细菌有作用对静止期细菌无作用；③因为哺乳类动物和真菌细胞无细胞壁，故青霉素对人毒性小，对真菌无效。
生产流程：冷冻干孢子→琼脂斜面→米孢子→种子罐→发酵罐→过滤→醋酸丁酯提取→脱水脱色→结晶→洗涤晶体→工业盐→菌丝体→综合利用在发酵过程中添加碳源、氮源和前体、消泡剂
三、青霉素产生菌的选育
1、出发菌株的选择
青霉素产生菌主要是产黄青霉51-20和点青霉。以产黄青霉51-20的菌株为亲株，经不断诱变，目前已获得产青霉素为30000u/ml以上的高产菌株。青霉菌在固定培养基上具有一定形态特征。开始生长时，孢子先胀大，长出芽管并急速伸长，形成隔膜，繁殖成菌丝，然后产生复杂的分支，交织成网状而形成菌落。
菌落外观有的平坦有的褶皱很多。在营养分布均匀的培养基中，菌落一般都是圆形的，其边缘或整齐或呈锯齿状或呈扇状。在发育过程中跟中从气生菌丝大梗和小梗，于小梗上着生分生孢子，排列成链状，形状似毛笔，称为青霉穗。
分生孢子成黄绿色、绿色或蓝色，老了以后变成黄棕色、红棕色和灰色等。分生孢子有椭圆形、圆柱形、圆形，每种菌种的孢子菌具有一定的形态，多次传代后也不变。在沉默培养是一般不产生分生孢子。
2、切断支路代谢途径
当菌种的初级代谢和次级代谢处于分路途经事，初级代谢产物的营养缺陷型菌株常可使相应的次级代谢产物增产。有人采用了诱变的方式获得了亮氨酸营养缺陷型菌株结果是青霉素的产量提高了四倍。
青霉素的生物合成受赖氨酸的反馈抑制，这是由于赖氨酸可使高柠檬酸合成受到抑制或阻遏，因侧悬于赖氨酸缺陷突变菌株，通过在培养基中添加赖氨酸，可使青霉素产量明显提高。
3、选育结构类似物抗性突变株
（1） 筛选自身耐受性突变株
不同活性的菌株，其自身耐受性不同，高产菌株能耐受高浓度的自产抗生素。为此，可以用自产抗生素来选育高产菌株。如有人选遇到能耐100000u/ml青霉素V的突变菌株，是青霉素的发酵单位提高到约40000u/ml。这种自身耐受性突变型菌株可能是由于反馈抑制被解除，使青霉素合成酶的活力大为提高，因而促进青霉素V的合成。
（2）筛选前提或前体类似物抗性突变菌株
毒性前提或其类似物对某些微生物的生长产生抑制作用，且可抑制代谢中产物的生物合成。选育毒性前提及其类似物的抗性菌株，就可以消除他们对微生物生长及其生物合成终产物的抑制作用，提高终产物的产量。以苯氧基乙酸为青霉素发酵的前体，选用耐1.3%苯氧基乙酸的突变株，青霉素V的发酵单位可达50000u/ml。此外选育苯乙酸、苯乙酰胺抗性突变株，也可以明显提高青霉素的产量。
（3）选育营养缺陷型的回复突变株
有人采用将原养性菌株诱变成营养缺陷型菌株，再诱变成原养性菌株的途径，获得了比亲株单位高2倍的青霉素高产菌株。当一种初级代谢产物是次级代谢产物而前体时，这种初级代谢产物营养缺陷型的恢复菌株可能是获得高产菌株的一种有效方法。有人采用了诱变的方法获得了a-氨基乙二酸缺陷的回复突变株，截过是青霉素的产量提高了2.4倍。此外选育半胱氨酸缺陷型的回复突变株，异亮氨酸缺陷型回复突变株和苏氨酸缺陷的回复突变株，均可使青霉素的产量大幅度的提高。
4、增加前体物的合成
缬氨酸是青霉素合成的前体物。如前所述，乙酰羟酸合成酶将丙酮酸转变成乙酰乳酸，最后形成缬氨酸。但是过量的缬氨酸会反馈抑制乙酸羟胺合成酶。通过诱变选育的产黄青霉的青霉素高产菌株，L-缬氨酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制比亲株小得多，从而使细胞内积累较多的缬氨酸，结果是青霉素产量大幅度的提高。
5、选育形态突变株
在长期的选育过程中，发现青霉菌在产量逐步提高的过程中，菌落直径逐渐变小，菌体表面结构由平坦变为褶皱，孢孢子也逐渐减少。头孢菌素产生菌在沉默培养基中，呈现菌丝、节孢子、分生孢子等多种形态，菌丝分化期转移至节孢子阶段直接与β-内酰胺抗生素合成的最高速度相吻合。随着发酵液中节孢子数量的增多，抗生素的活性也增大。因此通过挑选形态突变株，可获得青霉素高产菌株。
6、其他标记
（1）筛选抗生长抑制剂突变株
在青霉菌和头孢霉菌选育中，经常应用筛选抗重金属离子突变株的方法。重金属离子本身有毒性，与青霉素结合能消除毒性，产生抗性菌株，可提高抗生素的产量。
(2)筛选耐消泡剂的菌株
在青霉素的生产中，需耗费大量的植物油，为减少植物油的消耗，可以筛选耐合成消泡剂的高产突变株，其方法是在培养基中加入合成消泡剂，挑取耐消泡剂的高产菌株用于生产。
(3)选育细胞膜渗透性良好的菌株
有人通过诱变的方法获得了产黄青霉细胞膜渗透性发生改变的突变株，发现其摄取无机硫酸盐的能力比亲株提高了两到三倍，并可减轻了无机硫的调节机制控制，从而有效的转变了半光氨酸，结果青霉素的产量提高了2.4倍。
(4)构建基因工程菌株
前苏联科技工作者利用基因工程技术，将青霉素G酰化酶基因进行了克隆强化了青霉素生物合成能力，构建出的工程菌株，其青霉素的产量可提高3.3倍。
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四、发酵的优化控制
1、碳源
青霉素能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖甘露糖、淀粉、天然油脂等乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是很好的碳源，但必须控制好其加入的浓度，因为葡萄糖容易被菌体氧化并产生抑制抗生素合成酶形成的物质，从而影响青霉素的合成，所以采用连续添加葡萄糖的方法来代替乳糖。
苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素G的侧链前体。菌体对前体的利用有两个途径：直接结合到产物分子中，或作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。前体究竟通过哪个途径被菌体利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。例如早期采用的Q-176菌株将大部分前体（71%-94%）氧化消耗掉，只有2%-10%转化为青霉素。而现代工业所用的菌种，前体转化率为46%-90%，为了避免前提加入浓度过大而对菌体有毒害，除基础料加入0.07%的前体外，其余按需要同氮源一起补入。
卢里叶等比较了苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性。除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取决于培养集中的PH和前体浓度。苯乙酰胺在碱性时有毒，PH8时抑制霉菌生长；苯乙酸在酸性（PH5.5）时毒性较大，碱性时不抑制菌体生长；当培养基PH为中性时，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于0.1%时，除苯氧乙酸外，青霉素的生物合成均下降，尤其苯乙酰胺。一般认为，发酵液中前体浓度以始终维持在0.1%为宜。
在碱性条件下，苯乙酸被菌体氧化的速度随培养基的PH上升而增加。年幼的菌丝不氧化前体，而仅用它来构成青霉素分子。随菌龄的增长，氧化能力逐渐增加。培养及成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少。在摇瓶发酵试验中发现，通通气条件差的情况下，微生物氧化前体的能力显著降低。
为了减少苯乙酸的氧化，在生产上多用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的方法，以保持前体的供应速率仅略大于生物合成的需要。据报道，用蔗糖和苯乙酸钠盐压成的片剂对青霉素摇瓶发酵进行间歇补料，这种片剂内含物在溶液缓慢释放，以控制其释放的时间和速度。采用这一方法，发酵9天，青霉素单位可高达16150u/ml.
2、PH
在青霉素发酵过程中，PH是通过下列手段控制的：如PH过高，则添加糖、硫酸和无机氮源；若PH较低，则加入CaCO3 、氢氧化钠、氨或尿素，也可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液PH维持在6.8~7.2,以提高青霉素的产量。
据报道，用补糖来控制PH比用酸碱来控制要好。一种方法是采用恒速补糖，用酸碱来控制PH，另一种方法是根据PH来补糖，即PH上升快就多补，PH下降时就少补，以维持PH在6.6~6.9的范围内。
3、温度
青霉菌生长的适宜温度时30℃，而分泌青霉素的适宜温度为20℃左右，生产上采用变温控制法，使之适合不同阶段的需求。如采用从26℃逐渐降温至22℃的发酵温度，可延缓菌丝衰老，增加培养液的溶氧浓度，延长发酵周期，有利于发酵后期青霉素单位的增长。
Constantinides等人对青霉素分批发酵进行了研究，并以所得实验数据进行发酵实验：0~56h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184h最后24h回复到27.2℃培养。采用这种变温培养方法比常温25℃培养产量增加了16%。
4、补料
发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及PH外，补加氮源可提高发酵单位。经实验证实：若在发酵60~70h开始分次补加硫酸铵，则在90h后菌丝含氮量几乎不下降，维持在6%~7%，且60%~70%的菌丝处于年幼阶段，菌丝呼吸强度维持在CO2量为16µl/(mg菌丝·h),且抗生素的产量下降为零，总产量仅为试验罐得1/2。因此，为了延长发酵周期，提高青霉素产量，发酵过程分次补加氮源也是有效的措施。又如在基础料中加入0.05%的尿素，并在补糖时加2次尿素，可以扭转发酵液浓度转稀、PH低和青霉素单位增长慢的情况。
在发酵过程中与料液一起补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/l，或聚氧乙烯、单油酸酯和三油酸酯等非离子表面活性剂也能增加青霉素的产量。
在青霉素发酵过程中加入少量可溶性高分子化合物，如40mg/l聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺，能是青霉素产量增加38%.
这些物质能够提高产量的原因是：（1）当发酵罐使用较大的搅拌功率和较快的搅拌叶尖速时，这些高分子化合物能使临近搅拌叶的液体速度梯度降低，避免打断菌丝，而且促进氧在培养基中充分溶解的同时还有利于除去CO2。（2）菌丝生长时，由于高分子化合物起到分散剂的作用，菌丝不致成团，界面面积得以增加，因而增加了氧传递到菌丝体内的总速度。
5、铁离子的影响
三价铁离子对青霉素生物合成有显著的影响，一般若发酵液中Fe3+含量超过30~40ug/ml，则发酵单位增长缓慢，因此，铁罐在使用前必须处理，可在罐上涂上环氧树脂等保护层，使Fe3+ 的含量控制在30ug/ml以下。
综合上述条件控制，在实际生产过程中，结合工人的经验能获得较为理想的结果。
来源与参考：
[1] 张克旭.《代谢控制发酵》[M].北京：北京轻工业出版社，2010：399-423
[2] 熊宗贵.《发酵工艺原理》[M].北京：北京中国医药科技出版社，1995：126-153
[3]https://wenku.baidu.com/view/c5998b0d76c66137ee061969?aggId=c5998b0d76c66137ee061969&fr=catalogMain&_wkts_=1674350867900&bdQuery=%E7%9B%8A%E7%94%9F%E8%8F%8C%E5%8F%91%E9%85%B5&wkQuery=%E9%9D%92%E9%9C%89%E7%B4%A0%E5%8F%91%E9%85%B5
[4]张敬书. 青霉素发酵工艺优化研究[D].河北科技大学,2013.
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