在自然演化过程中，多倍化和全基因组复制事件常常被被认为是物进化的推动力，它们为生物进化提供了原始的遗传材料，同时也导致了物种的倍性差异。倍性直接影响基因组的大小和复杂性，不同倍性的物种需要不同的组装策略，对于多倍体物种，可能需要采用特殊的算法和工具来处理重复序列和同源区域。因此我们在进行基因组评估之前，需要先做一下倍性分析。
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倍性分析有哪些方法？
通过促进细胞有丝分裂，使用秋水仙素使细胞分裂停止在有丝分裂中期，然后固定、酶解、染色、烘烤等方法将细胞染色体固定在载玻片上，使用核型分析显微镜观察分析染色体的数目以及形态；
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什么是k-mer？
k-mer是指包含在一段序列中的长度为k的子串。
现有一段序列，长度是15个碱基，把k的长度设置成5，这意味着需要从这段序列上，每隔一个碱基取一个长度为5个碱基的序列片段。那么序列长度为15的序列可以取11个5mer。如图：
注意：
K需为奇数，防止正反链混淆；
针对长度为K的K-mer，对于 A,T,C,G四种碱基类型，一共能产生的K-mer种类数为4^k个。
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jellyfish+Smudgeplot
1.获取k-mer频数分布表（假设样本名为A）
ls /Data/A* | awk '{ print "gzip -dc " $0}' > A_generate.filejellyfish count -t 20 -C -m 21 -s 3G -g A_generate.file -G 2 -o A.sif# jellyfish count：k-mer计数# -t 指定线程数# -C 对DNA正负链都进行统计，表示考虑DNA正义与反义链。如果是双端测序reads，需要这个参数。# -m k-mer长度设置为21bp.# -s 3G 存储用的hash表大小为3G，这个参数识别单位M(Mbp)和G(Gbp)。如果设置不够大，会生成多个hash文件。最好设置的值大于总的独特的(distinct)k-mer数。如果基因组大小为G，每个reads有一个错误，总共有n条reads，则该值可以设置为[(G + n)/0.8]。# -g --generator=path 记录产生fast[aq]命令的文件# -G 同时运行的数目# -o 指定输出文件的名字，hash格式储存的k-mer频数文件
2.统计k-mer频率
jellyfish histo -v -t 20 -h 10000000 -o A.histo A.sif# 结果最后是两列，第一列是x，表示的是出现的次数；第二列是y，表示出现x次数的kmer数目。# -v 显示详细信息# -t 线程数# -h x的最大值，默认是10000# -o 输出文件的名字。
# 估计覆盖阈值上(U)下(L)限U=$(smudgeplot.py cutoff A.histo U)L=$(smudgeplot.py cutoff A.histo L)# 计算k-mer pairsjellyfish dump -c -L $L -U $U A.sif | smudgeplot.py hetkmers -o kmer_pairs# dump:将Jellyfish计数后的k-mer数据转储（dump）出来。# -c 参数表示输出覆盖度（coverage）信息# -L $L 和 -U $U 参数分别表示覆盖度的下限（lower bound）和上限（upper bound），确定的合理阈值。# smudgeplot.py hetkmers 寻找杂合k-mer pairs
# 绘图smudgeplot.py plot kmer_pairs_coverages.tsv -o my_genome# 结果图片：my_genome_smudgeplot.png# 具体数值：my_genome_summary_table.tsv
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KMC+Smudgeplot
1.用KMC计算k-mer频率，生成k-mer直方图（假设样本名为A）
mkdir tmpls /Data/A* | awk '{ print "gzip -dc " $0}' > A_generate.filekmc -k21 -t16 -m64 -ci1 -cs10000 A_generate.file kmcdb tmp #计算k-mer频率# -k21：k-mer长度设置为21# -t 指定线程数# -m64：内存64G，设置使用RAM的大致数量，范围1-1024。# -ci1 -cs10000：统计k-mer coverages覆盖度范围在[1-10000]。# A_generate.file:保存了输入文件列表的文件名为A_generate.file# kmcdb：KMC数据库的输出文件名前缀# tmp：临时目录kmc_tools transform kmcdb histogram A.histo -cx10000 #生成k-mer频数直方表A.histo和k-mer直方图# -cx10000：储存在直方图文件中counter的最大值。
# 估计覆盖阈值上(U)下(L)限U=$(smudgeplot.py cutoff A.histo U)L=$(smudgeplot.py cutoff A.histo L)# 用kmc_tools提取k-merskmc_tools transform kmcdb -ci"$L" -cx"$U" reduce kmcdb_L"$L"_U"$U"# 用KMC的smudge_pairs计算k-mer pairssmudge_pairs kmcdb_L"$L"_U"$U" kmcdb_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv kmcdb_L"$L"_U"$U"_pairs.tsv > kmcdb_L"$L"_U"$U"_familysizes.tsv
# 绘图smudgeplot.py plot kmcdb_L"$L"_U"$U"_coverages.tsv -o my_genome# 结果图片：my_genome_smudgeplot.png# 具体数值：my_genome_summary_table.tsv
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结果解读
在当前文件夹中会存在2个图片，三个文件。其中最重要的结果图片是 my_genome_smudgeplot.png，横轴是杂合k-mer对的深度占总深度的比例，纵轴是所有k-mer对的总深度，二者的交点即代表了不同的杂合结构。交点的亮度代表了落入其中的k-mer数。下图表示AAB可能性最高，所以推测是三倍体。
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