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2024 年 6 月 18 日，复旦大学脑科学研究院韩清见研究员联合王彦青、吴瑞琪课题组，在探究跨膜通道样蛋白 TMC6 介导的温度感知中取得系列进展，相关研究成果以题为“TMC6 Functions as a GPCR-like Receptor to Sense Noxious Heat Via Gαq Signaling”发表于 Nature 子刊《Cell Discovery》[1]（IF:13)。这项研究依托国产超高场临床前科研磁共振——联影生命科学仪器uMR 9.4T，利用高性能的功能性磁共振成像（fMRI）技术，对野生型（WT）小鼠和 TMC6 基因敲除小鼠的脑功能活动进行了比较分析，研究成果为理解 Tmc6 基因在神经系统中的功能提供了科学依据。研究团队发现，TMC6 是一种在背根神经节（DRG）神经元中高度表达的膜蛋白，其功能尚未完全阐明。研究结果表明，TMC6 可以直接作为偶联 Gαq 的 GPCR 样受体感知有害热量。TMC6 缺陷的小鼠在有害热感知方面表现出显著缺陷，但不影响冷、温暖、触觉和机械性疼痛等其他感知。这项研究首次阐明了 TMC6 在生物体热感知中的独特功能，为深入理解温度感知的分子机制提供了新的视角。为何我们能感知疼痛，这一议题既引人入胜又历史悠久。在人类与外界互动的广阔领域中，远距离的信息获取依赖于视觉与听觉，使我们能够看见、听见遥远之处的景象与声响。而当距离拉近，触觉便成为至关重要的交流方式，它赋予我们感受与反馈的能力，比如对温度的直接体会。温度感知对生物的生存、繁衍至关重要，一些极端温度刺激不仅会导致组织损伤、引发痛感，甚至会危及生命。在漫长的进化历程中，生物体演化出了精妙的温度感知系统，以进行自我保护。对温度感知受体的研究，以往多以瞬时受体电位（Transient receptor potential, TRP）通道超家族为主。值得关注的是，缺失相关 TRP 通道并不会完全丧失对某些温度的感知能力，这提示我们仍有未知的温度受体及温感机制值得深入发掘。近几十年来，感觉神经科学在识别热传感器方面取得了重大进展。离子通道和双孔域 K+（K2P）通道已被鉴定为直接响应热刺激的热传感器，能够导致异源系统中的内向/外向电流或钙内流。然而，这些通道对应基因的单独、两两组合或甚至全部沉默仅轻微或部分损害小鼠的热感觉，这表明了体内热感觉机制的复杂性。最近，越来越多的证据表明 G 蛋白偶联受体和 G 蛋白信号通路广泛参与热感觉的形成。然而，关于在哺乳动物中是否存在响应有害热的 G 蛋白偶联受体的研究还很缺乏。20 年前，由 TMC1-8 组成的 TMC 亚家族在遗传性耳聋基因的定位克隆和序列同源性搜索中首次被鉴定出来。然而，TMC 蛋白家族中其他亚型蛋白在哺乳动物中的生理功能和作用机制一直以来也所知甚少。虽然 TMC1 和 TMC2 已被确定为位于耳毛细胞静纤毛顶端的机械敏感性离子通道，参与听觉转导，但其他 TMCs 的功能在很大程度上仍不清楚。为明确其他 TMCs 的功能，本研究在哺乳动物小鼠中鉴定出一种新型的有害热传感器 TMC6。它作为一种 GPCR 样受体，与 Gαq 偶联后，经 Gαq-PLC-IP3R-Ca2+ 信号通路来感知有害热，揭示了一种新的温度感知机制，也为临床上痛温觉异常相关疾病的治疗带来了新的靶点和思路。研究人员构建了 Advillin-Cre; Tmc6f/f（Avil-Cre;Tmc6f/f）小鼠，选择性地在 DRG 神经元和三叉神经节（TG）神经元中敲除 TMC6。研究进行了行为测试，包括热板测试、Hargreaves 测试、温度偏好测试、干冰测试、丙酮测试、von Frey 测试和粘纸去除测试。为表征小鼠对温度的偏好，在行为学实验层面使用了表征冷觉的行为学范式丙酮测试和干冰测试以及表征热觉的行为学范式热板测试和 Hargreaves 测试以及温度偏好测试。在测试中，小鼠可以在两个区域之间自由移动，参考区域保持在 35°C，测试区域的温度则从 5°C 到 56°C 不等（测试区域），一共记录了在 5 分钟、10 分钟和 15 分钟内测试区域的停留时间。本研究中还构建了基因敲除和条件敲除小鼠，为确认小鼠的生理功能不受影响，研究人员还使用了旷场、转棒等表征运动能力和情绪的行为范式并检测了小鼠生育是否符合孟德尔遗传定律。研究团队使用联影生命科学仪器生产的 uMR 9.4T 超高场临床前科研磁共振，配合 86 mm 直径收发一体容积线圈和定制的单环表面线圈进行成像。异氟烷诱导麻醉动物后，使用梯度回波-平面回波成像 （GE-EPI） 序列采集 fMRI 图像。采集参数如下：TR=2000ms; TE=16 ms; FA=60°–70°; FOV=19 × 15mm2; matrix size=96 × 76; slice number= 28; slice thickness=0.35mm; 550 repetitions。研究团队还使用了 FSE 序列获取 T2-weighted 解剖像。采集参数如下：TR=3000ms; TE=38.64ms; ETL=11; matrix size=256 × 202; 4 averages; slice number=28; slice thickness=0.35mm。在探究分子细胞机制时，研究人员大量使用了钙成像实验和细胞电生理实验，结合免疫共沉淀表型检测蛋白间相互作用以及行为学表型论证细胞信号通路各成分之间的逻辑关系。
研究人员检测了 TMCs 在 DRG 中的表达，发现 TMC6 在 DRG 中的表达明显高于其他 TMCs。此外，TMC6 在 DRG 中的表达明显高于脊髓（SC）、丘脑和体感皮层。这暗示了 TMC6 在周围神经系统中可能有重要的功能。为了进一步探究 TMC6 的作用，研究人员构建了 Tmc6 缺失的小鼠（Tmc6-/-）并确认其不影响小鼠的发育、生育、运动与机械痛和冷痛，但其热板测试和 Hargreaves 测试表现出明显的热敏感性受损。![]()
图 1. WT 小鼠和 Tmc6-/- 小鼠的热板和 Hargreaves 行为学试验小鼠温度偏好的行为学测试结果表明，当测试区域温度为小鼠认为有害的温度 50°C 和 53°C时，野生型小鼠显著回避进入测试区域，而 Tmc6-/- 小鼠则表现出与 Trpv1-/- 小鼠相似的对测试区域的回避明显减少。同时在温暖（41°C）和寒冷、凉爽（5°C、15°C）条件下，Tmc6-/- 小鼠对测试区域的回避与野生型小鼠相当。以上结果说明 Tmc6-/- 小鼠表现出和 Trpv1-/- 小鼠相似的伤害性热觉不敏感。
图 2. g-i WT、Tmc6-/- 和 Trpv1-/- 小鼠的温度偏好试验；WT、Tmc6-/- 和 Trpv1-/- 小鼠的温度偏好试验以上实验均在全局敲除 TMC6 的小鼠上进行的。DRG 神经元在伤害性热的感觉的初级传入中发挥重要作用。为了进一步确认是否是 DRG 神经元上的 TMC6 特异性地参与有害热觉的感觉，行为学测试结果表明只有有害的热感觉受到影响，而无害的冷、凉、温暖和机械感觉则没有受到影响，这与 Tmc6-/- 小鼠的观察结果一致。综上所述，DRG 神经元中表达的 TMC6，而不是其他组织或细胞类型中的 TMC6，介导了有害的热感觉。![]()
图 3. j 构建 Advillin-Cre; Tmc6-/- 小鼠的示意图；k-m Avil-Cre 、Tmc6f/f 小鼠的行为学试验；n 对 Avil-Cre、Tmc6f/f 小鼠在 48°C、50°C、53°C 和 56°C 条件下双向差 Sidak 多重比较检验分析的热板试验![]()
图 4. a Avil-Cre 基因分型; Tmc6f/f小鼠; b Avil-Cre 照射强度为 35% 的哈格里夫斯试验; Tmc6f/f小鼠; c d Avil-Cre 温度偏好试验; Tmc6f/f小鼠; e f Avil-Cre 温度偏好试验; Tmc6f/f 小鼠; g Avil-Cre 干冰试验; Tmc6f/f 小鼠伤害性冷敏感性试验; h Avil-Cre; Tmc6f/f 小鼠蒸发冷却敏感性的丙酮测试; i Avil-Cre 的 Von Frey 试验; Tmc6f/f 小鼠的机械痛基线; j Avil-Cre 的粘性去除试验; Tmc6f/f 小鼠的触觉敏感性有害的热感觉经周围神经系统传入、脊髓-丘脑上行输入整合后，可在大脑多个脑区中引发神经活动，例如形成感觉的初级躯体感觉皮层（S1）、参与决策的岛叶皮层（Ins）、参与厌恶情绪的杏仁核（Amyg）。为了研究 Tmc6-/- 小鼠的有害热感觉是否最终使得大脑神经活动发生了改变，研究人员使用了 10 只 WT 小鼠和 10 只 Tmc6 基因敲除（Tmc6-/-）小鼠进行了 fMRI 来研究小鼠在有害热感觉刺激下大脑活动。fMRI 是一种非侵入性的成像技术，它可以检测血氧水平依赖信号（BOLD信号），通过观察脑血氧水平变化来推测脑区的神经活动，对于脑科学和神经学的基础研究具有重要意义。实验结果显示，在 WT 小鼠中，施加在左后爪的有害热刺激（48°C）在多个大脑区域引发了强烈而广泛的激活，而 Tmc6-/- 小鼠对相同刺激的反应显著减弱，仅在中央杏仁核（ACC）、对侧岛叶和对侧杏仁核观察到微弱的激活。为了量化伤害感受脑区中 WT 小鼠和 Tmc6-/- 小鼠之间的特定差异，研究人员对每个区域的信号变化进行了统计学比较。WT 组的激活幅度几乎是 Tmc6-/- 组的两倍。与 WT 小鼠相比，Tmc6-/- 小鼠对有害热刺激的初级感觉皮层 S1（p = 0.028）、次级感觉皮层 S2（p = 0.043）、中央杏仁核 ACC（p = 0.022）、Ins（p = 0.028）和纹状体 CPu（p = 0.035）的激活幅度显著降低。综合以上证据表明 Tmc6-/- 小鼠表现出的有害热感觉的损伤与有害热刺激的外周传入减少进而减弱大脑神经活动有关。uMR 9.4T 系统超高的磁场场强，卓越的梯度性能（1000 mT/m的梯度强度与10000 T/m/s 的梯度切换率），在小鼠脑功能成像中体现出了无与伦比的优势。![]()
图 5. o上、下两组图像分别为 WT 小鼠大脑和 Tmc6-/- 小鼠大脑的激活图；p 使用 Mann–Whitney U test 比较 WT 小鼠与 Tmc6-/- 小鼠之间的 fMRI 信号变化（二）DRG 神经元中 TMC6 缺乏会减少有害的热诱发的 Ca2+ 反应和 DRG 神经元的放电为了进一步研究 TMC6 介导热感的分子细胞机制，研究人员转向细胞水平研究 TMC6 缺失对神经元兴奋性影响如何。研究人员使用了原代培养的野生型小鼠 DRG 神经元和 Tmc6-/- 小鼠 DRG 神经元，通过检测神经元内 Ca2+ 浓度和动作电位性质表征神经元兴奋性。Ca2+ 浓度方面，两种神经元均能正常响应 KCl 引发的胞内 Ca2+ 浓度升高，但 Tmc6-/- 小鼠 DRG 神经元由有害热诱导的胞内 Ca2+ 浓度升高幅度显著小于野生型小鼠 DRG 神经元，且响应有害热的 Tmc6-/- 小鼠 DRG 神经元也显著少于野生型小鼠 DRG 神经元。动作电位方面，Tmc6-/- 小鼠 DRG 神经元中响应 45℃ 有害热的神经元比例与野生型相比显著降低，且在该温度下，敲除小鼠 DRG 神经元的动作电位幅度、半峰宽等性质也显著小于野生型小鼠。以上结果说明 TMC6 缺失小鼠的有害热敏感性降低与 DRG 神经元的兴奋性显著降低有关。
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图 6. a-c 使用 Fura-2 比率钙成像对 WT 和 Tmc6-/- DRG 神经元进行了从 37°C 加热至 45°C 的实验; d-k 在浴液温度从 30°C 升高到 45°C 的条件下，记录了小 DRG 神经元的热诱发动作电位（AP）释放。l AvilCre；Tmc6f/f 小鼠 在 45°C 下的甩尾试验（三）由 TMC6 介导的内质网（ER）中的钙离子释放有助于由有害热刺激所引发的动作电位（AP）的生成Ca2+ 是一种重要的第二信使，通常储存在细胞内细胞器中，如线粒体、溶酶体和内质网，在神经系统中其内流活动通常反映神经元的兴奋性。为了进一步探究该热感受行为中的分子机制，研究人员首先确认了神经元中浓度升高的 Ca2+ 的来源。研究人员在缺少细胞外 Ca2+ 的情况下测试了有害热诱发的 Ca2+ 反应，观察到仅消除内质网的 Ca2+ 释放显著降低了培养的 WT DRG 神经元中有害热刺激诱导的 Ca2+ 反应以及反应性神经元的百分比，而消除线粒体或溶酶体中的 Ca2+ 无相关表型。这表明内质网储存是有害热引发的内部 Ca2+ 释放的主要来源。
以上结果引导研究人员向胞内基于 Gαq 信号的磷脂酶C（PLC）-Ca2+/1,4,5-三磷酸肌醇（IP3R）双信使系统考虑更深入的分子机制。考虑到内质网上的 ryanodine 受体（RyRs）和 Gαq 信号成分1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3Rs）在内质网钙释放中的关键作用，研究人员分别使用 RyRs 抑制剂或 IP3R 抑制剂处理神经元，观察其在有害热条件下的胞内 Ca2+ 浓度。结果显示，在无胞外钙的条件下抑制 RyRs 并不影响有害热引发的神经元钙反应，而抑制 IP3R 几乎消除了培养的 WT DRG 神经元中的钙反应。基于这一结果，研究人员进一步使用药理学手段特异性阻断 Gαq 信号成分中的重要环节 PLC，有效地减少了有害热诱导的细胞内 Ca2+ 反应以及有反应神经元的百分比。以上结果表明 TMC6 通过 Gαq 信号通路中的 PLC-IP3R 通路参与了有害热诱导的内质网 Ca2+ 释放，进而引发神经元兴奋，表现为有害热的感知。
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图 7. TMC6 通过 Gαq 信号通路中的 PLC-IP3R 通路参与了有害热诱导的内质网 Ca2+ 释放（四）TMC6 定位于细胞膜上，并通过 Gαq-PLC-IP3R 信号通路介导有害热诱导的内质网钙释放由 AlphaFold2、TMHMM 和 OPM2 模型预测：TMC6 由一个大的细胞外 N 端结构域组成，其中包含无序区域，随后是 10 个跨膜螺旋（TM1-TM10）和一个细胞内 C 端结构域。实验证据支持 TMC6 在细胞膜上的定位。为了研究 TMC6 是否通过 Gαq 信号通路调节有害热引发的内质网 Ca2+ 释放，研究人员对异源 HEK293T 细胞进行了 Ca2+ 成像。在有害热刺激下，温度从 37°C 升高到 42°C，TMC6 转染和未转染的细胞都表现出细胞内钙浓度的轻微增加。有趣的是，TMC6 转染的细胞除了钙浓度的背景增加外，还显示出明显的细胞质钙尖峰反应，而未转染的细胞没有表现出这种尖峰反应。
图 8. a 示意图展示了 TMC6 的拓扑结构; b 在过表达 N 端带有 HA 标签和 C 端带有 EGFP 标签的 TMC6 的仓鼠卵巢（CHO）细胞上，使用针对 HA 的抗体进行非渗透性活细胞标记; c,d 在过表达 HA-TMC6 的 CHO 细胞上进行细胞表面生物素化，并用针对 HA 和转铁蛋白受体（TfR）的抗体进行免疫印迹; e–g 过表达小鼠 TMC6 的 HEK293T 细胞在温度从 37°C 升高到 42°C 时的 Fura-2 比率钙成像。h–j 在无 Ca2+ 浴液中，过表达小鼠 TMC6 的 HEK293T 细胞在温度从 37°C 升高到 42°C 时的 Fura-2 比率钙成像这些结果表明 TMC6 介导了观察到的钙尖峰反应。为了确定 TMC6 介导的细胞质钙尖峰是细胞外钙内流还是内部储存释放的结果，研究人员在无细胞外钙的条件下进行了热刺激实验。在 TMC6 转染和未转染的细胞中，当细胞外 Ca2+ 缺失时，钙浓度轻微增加的表型消失了。然而，在 TMC6 转染的细胞中，有害热仍然可以诱导细胞质 Ca2+ 活化，并且这种现象可以被 IP3R 和 PLC 的抑制剂有效阻断。这些数据表明 TMC6 通过 Gαq 信号通路介导热诱导的内质网 Ca2+ 释放。（五）TMC6 与 Gαq 相互作用并介导有害热诱导的细胞内 Ca2+ 释放为了研究 TMC6 如何调控 Gαq 信号通路，研究人员在 ND7/23 细胞中进行了免疫沉淀-质谱（IP-MS）筛选 TMC6 的结合伙伴。通过 IP-MS 分析，观察到 TMC6 与几种 G 蛋白，特别是 Gαq 之间存在高置信度的相互作用。随后，通过免疫共沉淀实验，检测 FLAG 标记的 Gαq 和 HA 标记的 TMC6 或 TMC6 截断之间的相互作用。![]()
图 9. a 在过表达带有 HA 标签的 TMC6的ND7/23 细胞裂解物中，与针对 HA 的抗体共沉淀的蛋白质的质谱（MS）分析; b TMC6 与 Gαq 相互作用的计算机模拟; c d 过表达带有 HA 标签的TMC6 和带有 FLAG 标签的 Gαq 的 ND7/23 细胞裂解物分别用针对 FLAG（c）或 HA（d）的抗体进行免疫沉淀，并分别用针对 HA 或 FLAG 的抗体进行免疫印迹；e 在过表达 Gαq-FLAG 以及HA-TMC6、HA-TMC6Δ740–759、HA-TMC6Δ760–779、HA-TMC6Δ780–799 或 HA-TMC6Δ800–810 的 ND7/23 细胞裂解物中，用针对 FLAG 的抗体进行免疫沉淀；f Gαq-FLAG 与HA-TMC6 或 HA-TMC6 突变体相互作用的量化。未配对 t 检验。n = 3；g 在共表达 Gαq-FLAG 和 HA-TMC6 或 HA-TMC6Δ780–810 的 ND7/23 细胞裂解物中，用针对 FLAG 的抗体进行免疫沉淀；h Gαq-FLAG 与 HA-TMC6 或 HA-TMC6Δ780–810 相互作用的量化。未配对 t 检验。n = 4；i, j 在过表达 Gαq-FLAG 和 HA-TMC6 的 ND7/23 细胞裂解物中，用针对 FLAG 的抗体进行免疫沉淀，并在 ND7/23 细胞中用阻断肽氨基酸 780–810 处理（i），以及 HA-TMC6 与 Gαq-FLAG 相互作用的量化（j）。未配对 t 检验。n = 3；k–m 在 P0 时腹腔注射 AAV2/9-aa780–810的小鼠中，对培养的 DRG 神经元进行无 Ca2+ 浴液中的 Fura-2 比率钙成像，并从 37°C 加热至45°C研究人员发现 TMC6 的 C 端 780-810 氨基酸区域对于其与 Gαq 的相互作用至关重要，删除氨基酸 780-810（TMC6Δ780–810）后，TMC6 和 Gαq 之间的相互作用减少了 50%以上。通过在 DRG 中过表达多肽氨基酸 780-810 来破坏 TMC6 和 Gαq 之间的相互作用，有效减少了由热诱导的钙释放反应神经元的百分比。总的来说，这些发现表明 TMC6 直接与 Gαq 相互作用，并以依赖于 Gαq 信号通路的方式介导细胞内 Ca2+ 的释放。
超高场磁共振成像技术在脑功能 fMRI 领域的应用为临床前研究带来了显著的优势和广阔的应用前景。超高场 MRI 系统因其高信噪比、高脑血氧水平依赖信号检测灵敏度，以及微米级的高分辨率成像能力，使得科学家能够在模式动物模型中进行更深入的脑功能研究，这些研究有助于将基于动物模型的基础研究成果进行临床转化，推动神经科学研究的进展。
在此次研究中，研究人员利用 uMR 9.4T 的功能成像，在脑科学领域佐证了动物机体温觉感受异常的分子机制，为神经科学领域进一步使用磁共振系统进行复杂表型的神经活动检测提供了经典应用案例，为其在基础研究领域和临床前领域的应用提供了优秀范例。
[1]Zhang C, Tong F, Zhou B, He M, Liu S, Zhou X, Ma Q, Feng T, Du WJ, Yang H, Xu H, Xiao L, Xu ZZ, Zhu C, Wu R, Wang YQ, Han Q. TMC6 functions as a GPCR-like receptor to sense noxious heat via Gαq signaling. Cell Discov. 2024 Jun 18;10(1):66.
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