DNA碱基编辑工具的进步为疾病治疗带来了巨大的希望，可修复由单核苷酸多态性(SNPs)[1]引起的单基因遗传疾病。目前，胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器主要依靠脱氨酶将胞嘧啶 (C) 或腺嘌呤 (A) 转化为尿嘧啶 (U) 或肌苷 (I)，脱氨后的U和I会分别被识别为胸腺嘧啶 (T) 和鸟嘌呤 (G)，从而促进C-to-T和A-to-G碱基变化[2-4]。在此基础上，进一步引入DNA糖基化酶切割中间产物U或I，产生无尿嘧啶/无嘧啶位点(AP位点)，可以实现碱基的颠换，包括C-to-G转换的CGBE[5-6]和A-to-T/C转换的AYBE[7-8]。但以上碱基编辑工具均依赖脱氨酶，限制了它们编辑T和G的能力，并且由于脱氨酶的过表达会引起一定的脱靶效应。
Nature Communications
2024年7月30日，北京大学魏文胜课题组在Nature Communications杂志在线发表题为 “Programmable DNA pyrimidine base editing via engineered uracil-DNA glycosylase”的研究论文，报道了一种名为TBE (Thymine base editor) 的不依赖脱氨酶的DNA碱基编辑工具。与现存的其他胸腺嘧啶编辑工具相比，TBE表现出更高的编辑效率、更小的细胞毒性和更低的脱靶现象。
图1 不依赖于脱氨酶的碱基编辑器
研究人员关注到人源化尿嘧啶DNA-糖基化酶 (hUNG) 的两个突变体可以在体外实现对胞嘧啶和胸腺嘧啶的直接切割[10]。因此，通过将hUNG突变体与Cas9蛋白结合，sgRNA靶向编辑位点可以在体内实现对DNA序列中的C和T的直接编辑 (图1)，其中在报告系统上编辑C的效率可达到30%，与现存的CGBE编辑效率类似，但针对T的hUNG突变体编辑效率较低。
为了进一步提高胸腺嘧啶的编辑效率，研究人员通过对UNG结构理性设计、同源蛋白检索、定向进化筛选的策略找到了来自耐辐射奇球菌 (Deinococcus radiodurans) 的尿嘧啶DNA-糖基化酶 (DrUNG) 突变体可以在多个人类基因组位点上实现高效的胸腺嘧啶编辑 (图2)，编辑结果显示平均T-to-C, T-to-G及T-to-A的比例为52%, 30%和18%。通过优化连接氨基酸、引入具有合成倾向性的DNA聚合酶，还可以进一步提高编辑效率与编辑纯度。全面评估显示，TBE在基因组或转录组水平上都不会导致严重的脱靶编辑，这表明其具有高度的编辑特异性。
图2 TBEs在人类基因组多个内源位点实现高效的编辑
近期，多个团队也报道了基于人源化糖基化酶的胸腺嘧啶碱基编辑器[11-12]。通过比较32个内源位点编辑结果，研究人员发现与基于人源的胸腺嘧啶碱基编辑器相比，TBE展现出更高的编辑效率。此外，细胞毒性实验也表明TBE具有更小的细胞毒性。
最后，通过将DrUNG突变体的mRNA与nickase SpCas9融合蛋白和sgRNA共转染到原代成纤维细胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷细胞中，可以观察到该酶活性的恢复，证明了TBEs在相关疾病治疗方面的潜在应用前景。
北京大学/昌平实验室魏文胜课题组博士后伊宗裔、博士后张小雪、博士研究生魏晓旭、本科生李佳怡（2024级研究生新生）为论文的共同第一作者。本研究获得了国家自然科学基金，昌平实验室，北大-清华生命科学中心及中国博士后科学基金资助。
参考文献：
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魏文胜：
北京大学生命科学学院教授、博士生导师；北京大学生物医学前沿创新中心、北京大学-清华大学生命科学联合中心、北京未来基因诊断高精尖创新中心，研究员。
实验室研究领域：
1. 基因编辑技术
2. 新型基因治疗及疫苗技术
3. 高通量功能基因组学
4. 重大疾病发生机制
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